定抽顆粒對抽動障礙模型小鼠行為學及氨基酸類神經(jīng)遞質的影響

朱先康解瑩晶趙 艷

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210029）

定抽顆粒對抽動障礙模型小鼠行為學及氨基酸類神經(jīng)遞質的影響

朱先康1解瑩晶2趙 艷2

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210029）

目的：探索定抽顆粒治療兒童抽動障礙的作用機制。方法：72只ICR小鼠隨機分為正常對照組、模型組、氟哌啶醇組和定抽顆粒高、中、低劑量組，每組12只。除正常對照組外，其余各組小鼠予亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射誘導抽動障礙模型。造模當日起，正常對照組和模型組給予蒸餾水，其余組每日分別給予氟哌啶醇 （1.38mg/kg）、定抽顆粒（5.76g/kg、2.88g/kg、1.44g/kg），連續(xù)灌胃3周。末次給藥后1h進行刻板行為、運動行為、自主活動測定，翌日采用高效液相色譜法檢測血漿及腦組織中γ-氨基丁酸（GABA）、天門冬酸（ASP）、谷氨酸（GLU）含量。結果：定抽顆粒各劑量組小鼠刻板行為、運動行為評分和自主活動次數(shù)均明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。模型組小鼠腦組織及血清中GABA含量明顯低于正常對照組（P＜0.01），腦組織中GLU、ASP含量明顯高于正常對照組（P＜0.01）；定抽顆粒各劑量組腦組織、血清中GABA含量明顯高于模型組（P＜0.01），腦組織中GLU、ASP含量明顯低于模型組（P＜0.01）。結論：定抽顆?？擅黠@改善抽動障礙模型小鼠行為學改變，其可能的作用機制與抑制興奮性氨基酸類神經(jīng)介質、興奮抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質有關。

抽動障礙 定抽顆粒 氨基酸類神經(jīng)遞質 行為學 ICR小鼠

兒童抽動障礙臨床較為常見，近年來發(fā)病率逐漸增高?，F(xiàn)代醫(yī)學對于抽動障礙的病因及發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)學者認為與遺傳因素、神經(jīng)遞質失衡、心理因素、某些病理因素（感染后自身免疫反應、圍生期產(chǎn)傷、難產(chǎn)等）有關。關于神經(jīng)遞質失衡學說，近年來有學者提出兒童抽動障礙發(fā)病可能與興奮性氨基酸含量過多，抑制性氨基酸含量過少有關[1]。興奮性氨基酸包括谷氨酸（glutamic acid，GLU）和門冬氨酸（Aspartate，ASP），抑制性氨基酸主要為γ-氨基丁酸（Gamma-Amino-Butyric Acid，GABA）。近十余年來，我們研制了定抽顆粒治療兒童抽動障礙，前期臨床研究療效確切[2]，但其作用靶點尚不明確。因此本實驗研究采用高效液相色譜法測定抽動障礙模型小鼠腦組織GLU、ASP、GABA及血清GABA的含量變化，觀察定抽顆粒調(diào)節(jié)氨基酸類神經(jīng)遞質的作用，探索其治療兒童抽動障礙的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 ICR小鼠72只，清潔級，16～20g，雄性，購于浙江省實驗動物中心，許可證號:SCXK（浙）2008-0033。

1.2 實驗藥物 定抽顆粒（膽南星6g、天麻12g、石菖蒲12g、柴胡6g、菊花6g、鉤藤10g、郁金10g、炙遠志6g、生地10g、炒白芍10g），由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。氟哌定醇，由上海信誼九福藥業(yè)有限公司提供，批準文號:國藥準字H31021234。亞氨基二丙腈（IDPN，90%），由上海至鑫化工有限公司提供。

1.3 實驗試劑 甲醇為色譜醇，由江蘇漢邦科技有限公司提供；曲唑酮、丹酰氯、醋酸鈉、庚烷磺酸鈉、四氫呋喃，由南京賽研科技有限公司提供；丙酮、高氯酸，由南京化學試劑有限公司生產(chǎn)。谷氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸標準品，均購自美國sigma公司。實驗用水為雙蒸水。

2 實驗方法

2.1 抽動障礙小鼠模型的建立 在前期課題研究中，我們對小鼠腹腔注射IDPN成功誘導了抽動障礙模型[2]，本次實驗我們也采用同樣方法造模。IDPN溶于生理鹽水中，使其終濃度為22mg/mL，每只小鼠每日腹腔注射IDPN 330mg/kg，連續(xù)注射7d。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水7d。

2.2 分組與給藥 ICR小鼠72只，隨機分為正常對照組、模型組、氟哌啶醇組和定抽顆粒高、中、低劑量組，每組12只。自造模當日起，正常對照組與模型組灌胃蒸餾水20mL/（kg·d），定抽顆粒高、中、低劑量組灌胃定抽顆粒5.76、2.88、1.44g/（kg·d），氟哌啶醇組 （陽性對照藥組）灌胃氟哌啶醇1.38mg/（kg·d），各組均連續(xù)灌胃3周。

2.3 觀察指標

2.3.1 刻板行為評分 將動物放入一較大的觀察籠內(nèi)，動物適應5min后，以Diamond等[3]抽動障礙動物模型中對刻板行為的評分方法，在最后一次給藥后1h，進行雙盲觀察1h，每5min記錄1次，統(tǒng)計總分。0分:無刻板行為；1分:旋轉行為；2分:頭和頸部的上下運動過多；3分:頭、頸部的上下運動過多加旋轉行為；4分:頭向側擺合并頭和頸部的上下運動過多。

2.3.2 運動行為評分 刻板行為評分結束后，立即將動物放入一較大的觀察籠內(nèi)，動物適應5min后，以抽動障礙動物模型中對運動行為的評分方法，觀察1h，每5min記錄1次，統(tǒng)計總分。0分:安靜或正?；顒?；1分:過度興奮；2分:探究行為增加；3分:跑；4分:跑和跳。

2.3.3 自主活動次數(shù)統(tǒng)計 參照Wei等[4]報道的方法，于運動行為評分結束后立即應用小鼠自主活動程序儀進行小鼠自發(fā)活動計數(shù)，當計算機進入測定程序后，將小鼠放入活動箱中（高13cm，直徑25cm），由計算機自動記錄小鼠活動情況，測定每只小鼠5min內(nèi)的活動次數(shù)。

2.3.4 腦組織及血清GLU、ASP、GABA的含量測定

末次給藥后夜間禁食不進水，翌日清晨采集腦組織、血漿樣本。用眼科鑷摘取小鼠眼球取眼眶血于離心管中并標號；取血后立即將小鼠頸椎脫臼處死，并在冰碟上迅速剝離出大腦組織，將腦組織放入凍存管并標號，迅速放入液氮中保存待測。標本采集完后取出液氮中保存腦組織的凍存管，放入-80℃冰箱保存。將裝有小鼠眼眶血的EDTA抗凝管置于離心機內(nèi)離心（3000r/min，10min，4℃），離心后取上清液，置于-80℃冰箱保存。處理腦組織樣品:取腦組織置于10mL圓頭離心管中，加入2～3mL 0.4mmol/L高氯酸，于勻漿機勻漿7min，用少量高氯酸清洗勻漿機，洗液并入離心管后置于離心機離心（10000r/min，10min，4℃），取上清液備用。衍生化反應:吸取腦組織勻漿上清液 250μL于 10mL離心管中，加入40μL內(nèi)標液曲唑酮，再加入100μL KHCO3，最后再加入200μL衍生試劑丹酰氯，置于80℃水浴30min，取出后加入100μL醋酸丙酮，冷卻后過0.23μm濾膜裝樣，進樣量20μL。使用高效液相色譜儀分別測定腦組織及血清中GLU、ASP、GABA含量。

2.4 統(tǒng)計學方法 本研究均使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用（±s）表示。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠刻板行為、運動行為評分及自主活動次數(shù)比較 見表1。實驗結果表明，模型組小鼠刻板行為、運動行為評分均明顯高于正常對照組（P＜0.01），提示本次實驗造模成功。定抽顆粒各劑量組與氟哌啶醇組一樣，均可以明顯降低IDPN誘導的抽動障礙模型小鼠刻板行為、運動行為評分及自主活動次數(shù)（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各組小鼠刻板行為、運動行為評分及自主活動次數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠刻板行為、運動行為評分及自主活動次數(shù)比較（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只）刻板行為評分（分）運動行為評分（分）正常對照組劑量12自主活動次數(shù)（次）0 0162.87±59.78 12氟哌啶醇組 12 1.38mg/kg 8.53±5.32△△10.67±9.12△△92.80±33.13△△定抽顆粒高劑量組 12 5.76g/kg 11.33±6.66△△15.33±6.17△△76.80±26.03△△定抽顆粒中劑量組 12 2.88g/kg 9.60±8.59△△14.53±4.81△△97.67±31.70△△定抽顆粒低劑量組 12 1.44g/kg 12.00±13.54△13.20±8.58△△82.40±25.46△△模型組 22.93±10.47##26.13±10.01##173.80±66.52

表2 各組小鼠血清及腦組織GLU、ASP、GABA含量比較（±s） μg/mL

表2 各組小鼠血清及腦組織GLU、ASP、GABA含量比較（±s） μg/mL

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與氟哌啶醇組比較，**P＜0.01；-表示未測出。

血清 腦組織組別 動物數(shù) 劑量GLUASP GABA GLU ASP GABA正常對照組 12-- 56.5083±11.77142 12.3433±5.1337851.8967±11.38978 6.3292±1.98249模型組 12氟哌啶醇組 12 1.38mg/kg - 36.7575±4.42748##42.7475±11.12761##- - 72.4450±3.38363△△8.3950±6.02136△△50.7050±7.75965△△4.9067±1.90961△△-144.8167±71.55752##1.1525±0.46276##定抽顆粒高劑量組 12 5.76g/kg定抽顆粒中劑量組 12 2.88g/kg - - 93.6083±7.80099△△**2.8167±1.45843△△53.3917±8.26234△△6.8058±2.26837△△- - 78.9525±8.24751△△3.3825±2.63765△△61.6508±15.27055△△5.1292±1.83260△△定抽顆粒低劑量組 12 1.44g/kg - - 65.7400±7.54871△△13.7992±8.28707△△46.3100±4.01259△△3.7850±2.53203△△

3.2 各組小鼠血清 GLU、ASP、GABA及腦組織GABA含量比較 見表2。與正常對照組相比，模型組小鼠血清及腦組織GABA含量顯著降低（P＜0.01），腦組織GLU、ASP含量明顯升高 （P＜0.01），說明IDPN所致的抽動障礙模型小鼠體內(nèi)存在著3種氨基酸類神經(jīng)遞質含量的變化，由此推測抽動癥的發(fā)病與GLU、ASP、GABA的含量失衡有關。與模型組比較，定抽顆粒各劑量組、氟哌啶醇組小鼠腦組織GLU、ASP含量明顯降低，血清和腦組織GABA含量明顯升高（P＜0.01）。由此推測定抽顆粒、氟哌啶醇的作用機制是調(diào)整抽動障礙小鼠體內(nèi)各類氨基酸類神經(jīng)遞質含量的平衡。與氟哌啶醇組相比，定抽顆粒高劑量組小鼠血清GABA含量明顯升高（P＜0.01），其余指標定抽顆粒各劑量組與氟哌啶醇組比較無統(tǒng)計學差異，因此在改善氨基酸類神經(jīng)遞質方面定抽顆粒與氟哌啶醇效果相當。

4 討論

兒童抽動障礙是一種比較常見的，由于遺傳缺陷和不良環(huán)境因素所致的，兒童時期起病的慢性神經(jīng)精神障礙性疾病，以慢性運動性抽動和（或）發(fā)聲性抽動為特征，患兒常伴有注意力不集中及強迫行為等，嚴重時可出現(xiàn)暴躁情緒或孤獨少語、學習困難、不能上學等情況。本病的發(fā)病可能與神經(jīng)遞質失衡及受體異常有關，西醫(yī)臨床首選的治療藥物是氟哌啶醇。氟哌啶醇為多巴胺受體阻滯劑，可阻斷腦內(nèi)多巴胺受體，并可促進腦內(nèi)多巴胺的轉化，從而達到治療抽動障礙的目的。

中醫(yī)認為本病多與先天稟賦不足、產(chǎn)傷、窒息、感受外邪、情志失調(diào)等因素有關，多因五志過極、風痰內(nèi)蘊而引發(fā)，病位主要在肝，涉及心、脾、腎三臟。近年來眾多學者提出腎虛肝旺、風痰阻絡、脾虛肝旺、心脾兩虛等病機觀點，對臨床治療有著重大的指導意義。根據(jù)我們多年診療經(jīng)驗，認為抽動癥的分型雖多，但臨床最為常見的尚屬腎虛肝旺、風痰阻絡，故研制出針對此證型的定抽顆粒。方中以生地、天麻、鉤藤為君藥。生地滋養(yǎng)腎陰，“壯水之主以制陽光”，滋水可涵木，從而抑制肝陽；天麻息風平肝，鉤藤味甘涼，有清熱平肝之效，二者均屬肝經(jīng)，共用可達平肝息風之效。柴胡、郁金為臨床常用疏肝解郁之藥，二者共用有助天麻、鉤藤平肝之效，均為臣藥。膽南星是制天南星的細粉與牛、羊或豬膽汁加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成，性苦寒，微辛，石菖蒲辛苦，性溫，二藥同用，有滌痰開竅之效。遠志祛痰開竅，有助膽南星、石菖蒲滌痰之功；菊花可清肝平肝；白芍酸以斂陰，苦寒以平肝，有斂陰平肝之效，同時有調(diào)和諸藥的作用。此外，本病患兒臨床多見心神不寧等表現(xiàn)，郁金、遠志相配有清心安神之效。生地、白芍相配，既滋養(yǎng)腎陰，又斂虛躍浮陽。諸藥合用，使得肝腎之陰得以養(yǎng)，肝之陽亢得以制，風痰得以祛，共奏滋腎平肝、息風滌痰之效。

興奮性氨基酸包括GLU和ASP，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質。GLU是哺乳動物腦內(nèi)含量最高的氨基酸，存在于相關神經(jīng)元及突觸中，集中于海馬、大腦皮質外層和脊髓膠狀質中。GLU由三羧酸循環(huán)合成或谷氨酰胺脫氨基而產(chǎn)生，在神經(jīng)突觸終末去極化時釋放入突觸間隙。GLU釋放后與不同的特異性受體結合，產(chǎn)生不同突觸后反應。作為主要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質，GLU通過特異性受體介導認知、學習、記憶等高級神經(jīng)活動。興奮性氨基酸不但可以通過與相應的受體結合參與中樞神經(jīng)信息傳遞，還可作為內(nèi)源性興奮毒素破壞中樞神經(jīng)細胞，導致神經(jīng)功能障礙。谷氨酸通過N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體參與調(diào)節(jié)紋狀體刻板行為，將谷氨酸直接注入紋狀體可以誘導動物出現(xiàn)旋轉行為。這種改變可能是由于谷氨酸含量的增加對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用。ASP也是腦內(nèi)重要的興奮性氨基酸，在脊髓主要集中于灰質背側。ASP大多經(jīng)GLU轉氨基作用生成，其分解代謝與GLU類似。GABA是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質，在中樞的含量非常高。實驗研究證實GABA有對抗興奮性氨基酸的作用及減輕缺血時對興奮神經(jīng)細胞的毒性作用[5]。

本研究表明，抽動障礙模型小鼠腦組織及血清中GABA的含量均有下降，腦組織中GLU、ASP的含量有提升，據(jù)此我們推測，腦組織中興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量的失衡可能是引起抽動障礙的原因之一。此外，定抽顆粒、氟哌啶醇均能提高腦組織及血清中GABA含量，降低腦組織中GLU、ASP含量，提示定抽顆粒、氟哌啶醇治療抽動障礙可能的機制之一是抑制興奮性氨基酸類神經(jīng)介質、興奮抑制性氨基酸類神經(jīng)介質。

本次實驗的動物造模，根據(jù)動物的刻板行為、運動行為、自主活動計數(shù)評分來看，抽動障礙癥的造模是基本成功的，但能否對應于腎虛肝旺、風痰阻絡的證型，還有待進一步研究。定抽顆粒是臨床上治療抽動癥腎虛肝旺、風痰阻絡證型的有效方藥，在實驗中建立病證結合的動物模型，對于中醫(yī)藥實驗研究來說是一個極大的考驗。

[1] 劉智勝，靜進.兒童心理行為障礙.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：143

[2] 朱先康，韓新民，王敏華.定抽顆粒治療小兒多發(fā)性抽動癥的臨床及實驗研究.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（2）：399

[3] Diamond B I，Reyes M G，Borison R.A new animal model for Touretee syndrome.AdvNeurol，1982，35：221

[4] Haifeng Wei，Lin Li，Qiujuie Song，et al.Behavioral study of the D2 galactose induced aging model in C57B L/6J mice.Behav Brain Res，2005，157（2）：245

[5] 郜旭，趙慶杰，吳秀萍，等.γ-氨基丁酸類藥物對急性腦梗死的保護作用及對興奮性氨基酸的影響.中國急救醫(yī)學，2004，24（9）：668

R749.940.5

A

1672-397X（2015）07-0080-03

朱先康（1955—），男，本科學歷，主任中醫(yī)師，從事兒科疾病的中醫(yī)藥診療研究。zhuxk09010@sina.com

2015-03-29

編輯：吳 寧

國家級重點學科南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科學第二期開放研究課題（EZK2012019）