補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

目的：觀察補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和Dickkopf-1（DKK-1）表達(dá)水平的影響，探討補(bǔ)腎利濕法防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理。方法：將84只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組及補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組，每組12只。空白組與模型組灌胃生理鹽水，中藥對(duì)照組和西藥對(duì)照組分別灌胃痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液，補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組分別灌胃18.7、37.4、74.8mL/kg補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方，每日1次，連續(xù)7d。隨后除空白組外，其余各組大鼠采用尿酸鈉和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。造模4h后眼眶取血，分離血清，應(yīng)用ELISA法，檢測各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量。結(jié)果：模型組大鼠血清hs-CRP和DKK-1均明顯高于空白組（P＜0.01）。各給藥組大鼠血清hs-CRP含量均明顯低于模型組（P＜0.01），其中以西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕中劑量組效果最為明顯。各給藥組大鼠血清DKK-1含量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方可降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清hs-CRP水平，對(duì)防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定作用；對(duì)降低DKK-1效果不明顯，可能與急性期血清中DKK-1表達(dá)特點(diǎn)有關(guān)，需要作進(jìn)一步研究。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 補(bǔ)腎利濕 中藥復(fù)方 hs-CRP DKK-1 病理學(xué) SD大鼠

痛風(fēng)（gouty arthritis，GA）是嘌呤代謝紊亂及/或尿酸排泄減少所引起的一種代謝性疾病。臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積所致的特征性急、慢性關(guān)節(jié)炎，病程日久可引起泌尿系結(jié)石或痛風(fēng)性腎病，導(dǎo)致腎功能不全，嚴(yán)重影響患者健康狀況和生存質(zhì)量[1]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis）是痛風(fēng)比較典型的表現(xiàn)形式。目前臨床仍以西藥為主來控制急性發(fā)作期的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，如促尿酸排泄劑、抑制尿酸生成劑、秋水仙堿、激素等。此類藥物雖作用迅速，但副作用多、中毒率高，易引發(fā)腎功能損害、皮膚過敏甚至毒性上皮壞死等，因此眾多中醫(yī)學(xué)者開始重視研究開發(fā)防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎安全有效的中藥制劑。本研究采用尿酸鈉聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，分別用秋水仙堿、痛風(fēng)舒片和補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方進(jìn)行預(yù)處理，觀察各組大鼠血清超敏 C反應(yīng)蛋白 （hs-CRP）和Dickkopf-1（DKK-1）表達(dá)水平，探討補(bǔ)腎利濕法防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD大鼠84只，體重（200±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):[SCXK（黑）2008004]。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[2]。

1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方由熟地黃20g、山藥15g、山茱萸20g、澤瀉15g、懷牛膝15g、萆薢20g、土茯苓30g組成[3]，方中藥材從黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房一次性選購。秋水仙堿購自西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140807；痛風(fēng)舒片（主要成分:大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己）購自湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140301；微量尿酸鈉結(jié)晶（批號(hào)CAS1198-77-2）、氧嗪酸鉀（批號(hào)CAS2207-75-2）均購自美國Sigma公司。hs-CRP試劑盒購于北京誠森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)201501。

1.3 儀器 多用途高速臺(tái)式離心機(jī) （貝克曼X-22R），電子分析天平（梅特勒公司AL204），酶標(biāo)儀（Gene Company synergy H7），恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒，型號(hào):DHG-9140A）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為7組，每組12只，分別為空白組、模型組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組。

2.2 藥物溶液制備 （1）尿酸鈉溶液的制備:將1g微晶尿酸鈉結(jié)晶加9mL無菌生理鹽水，加熱攪拌，定容成10mL尿酸鈉溶液。（2）氧嗪酸鉀溶液的制備:將3g氧嗪酸鉀晶體溶解于97mL生理鹽水中，加熱攪拌，配置成3%氧酸鉀溶液。（3）痛風(fēng)舒片溶液的制備:將痛風(fēng)舒片研成細(xì)末，配置成0.029g/mL的痛風(fēng)舒片溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）秋水仙堿混懸液的制備:將秋水仙堿片研成細(xì)末，配置成0.028mg/mL的秋水仙堿混懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方溶液的制備:將熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、懷牛膝、萆薢、土茯苓入砂鍋中加4倍體積的水浸泡30min，煎2次，30min/次，去渣，兩煎混合，G4濾器過濾，于60℃水浴中加熱，分別將原藥液1.87mL、3.74mL、7.48mL濃縮成1mL，密封隔水煮沸消毒，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 給藥方法 以每100g大鼠體質(zhì)量灌胃1mL為標(biāo)準(zhǔn)，空白組和模型組分別灌胃等量生理鹽水，中藥對(duì)照組和西藥對(duì)照組分別灌胃痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液，補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組分別給予補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方18.7、37.4、74.8mL/kg灌胃，各組均每日灌胃1次，連續(xù)7d，末次給藥后造模。

2.4 造模方法 用3%氧嗪酸鉀溶液 （15mL/kg）進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，15min后將大鼠仰臥固定，碘伏消毒右后肢小腿膝關(guān)節(jié)，用BD針在大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)右后側(cè)從30°～40°方向插入至肌腱內(nèi)側(cè)，有落空感后，注入10%尿酸鈉溶液0.2mL，制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。空白組右后肢膝關(guān)節(jié)注射等體積生理鹽水。

2.5 血清樣本采集 造模4h后眼眶取血，室溫下放置30min，3500r/min離心15min，分離血清，-4℃冰箱凍存待測。

2.6 hs-CRP、DKK-1含量測定 取血清上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）測定血清中hs-CRP、DKK-1的濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.7 關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢查 用銳利刀片取受試關(guān)節(jié)滑膜組織，95%乙醇固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病變。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用One-Way ANOVA分析，多組樣本均數(shù)間比較選擇單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)，所有計(jì)量資料用（±s）表示。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較 結(jié)果見表1。與空白組比較，模型組大鼠hs-CRP、DKK-1水平明顯增高（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組hs-CRP水平均明顯降低（P＜0.01），提示各組藥物均對(duì)降低hs-CRP水平有作用。其中，西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕中劑量組效果更明顯，此2組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。血清DKK-1水平方面，與模型組比較，補(bǔ)腎利濕中劑量組和西藥對(duì)照組均有較大程度的降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥對(duì)照組比較，△P＜0.05；與中藥對(duì)照組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量hs-CRP（μg/L）DKK-1（μg/L）空白組120.39±0.02 0.93±0.04模型組 12 0.89±0.06**1.06±0.11**中藥對(duì)照組 12 2.9×10-1g/kg 0.69±0.07**##1.05±0.06**西藥對(duì)照組 12 2.8×10-4g/kg 0.49±0.05**##▲0.98±0.09補(bǔ)腎利濕低劑量組 12 18.7mL/kg 0.63±0.06**##△1.06±0.14**△補(bǔ)腎利濕中劑量組 12 37.4mL/kg 0.48±0.04**##▲0.97±0.07補(bǔ)腎利濕高劑量組 12 74.8mL/kg 0.63±0.05**##△1.02±0.07

3.2 病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊。模型組滑膜細(xì)胞排列不整，表面滲出，有不同程度的壞死，滑膜組織內(nèi)見有尿酸鹽結(jié)晶體，結(jié)合血尿酸測定，提示造模成功。中藥對(duì)照組滑膜組織仍見水腫、壞死、大量中性粒細(xì)胞浸潤，炎性滲出減輕。西藥對(duì)照組滑膜組織仍有水腫炎細(xì)胞浸潤，滲出不明顯。補(bǔ)腎利濕低劑量組滑膜組織仍有明顯水腫，炎細(xì)胞浸潤；中劑量組滑膜組織輕度水腫，滲出減輕，少量炎細(xì)胞浸潤；高劑量組滑膜組織仍見有退變、水腫、大量中性粒細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理組織學(xué)圖片（HE染色，×400）

4 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎歸屬于中醫(yī)學(xué)痹證范疇。醫(yī)圣張仲景所著《金匱要略》中提及“歷節(jié)”，與本病癥狀相似，后世醫(yī)家多沿用此病名，并根據(jù)其痛勢劇烈的特點(diǎn)稱之為“白虎風(fēng)”、“歷節(jié)風(fēng)”。近代醫(yī)家認(rèn)為本病病因多由于人體遭受風(fēng)寒、濕熱之邪侵襲，致氣血、經(jīng)絡(luò)受病邪閉阻而引起關(guān)節(jié)紅腫熱痛、畸形等癥。我們根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，詳審本病病機(jī)，認(rèn)為痛風(fēng)應(yīng)從腎論治[4]。腎主水，且為一身陰陽之根本，人身水液代謝雖有多種臟器參與，歸根結(jié)底全賴腎陽蒸騰氣化作用。若先天不足或后天調(diào)養(yǎng)不當(dāng)引起腎臟虧虛，以致腎不溫化，濕濁內(nèi)泛，久蘊(yùn)不去，釀生濁毒，加之外受風(fēng)寒濕熱之邪，內(nèi)有七情勞倦之災(zāi)，或關(guān)節(jié)外傷，天虛人虛，兩害交加，濕濁隨氣機(jī)運(yùn)行無處不到，流注關(guān)節(jié)、肌肉則為痹為痛?！端貑枴ぬ庩柮髡摗吩啤皞跐裾撸孪仁苤?，指出了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀以下肢關(guān)節(jié)受累為主的原因。綜上所述，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬本虛標(biāo)實(shí)，以腎臟虧虛為本，氣滯、血瘀、濕聚、痰凝、熱蘊(yùn)雜合為標(biāo)，治以補(bǔ)腎利濕法。補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方由資生腎氣丸化裁而來，方中熟地黃氣味厚重以滋陰補(bǔ)腎、填精益髓，山茱萸酸、微溫以補(bǔ)益肝腎、收斂固澀，兩藥配合，肝腎并補(bǔ)，取“肝腎同源”之意，加入山藥補(bǔ)脾益氣，三藥合用，意在三陰并補(bǔ)，復(fù)其在內(nèi)之真陰。純用補(bǔ)益之劑，味厚而有壅滯之弊，難免事倍功半，根據(jù)本病補(bǔ)腎之治法，加入澤瀉利濕以泄腎濁，調(diào)和熟地滋膩之性，另據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，澤瀉有明顯的利尿和抗炎作用[5]。萆薢利濕去濁，祛風(fēng)除痹；土茯苓清熱解毒，除濕通絡(luò)；牛膝活血通經(jīng)，舒筋利痹，引血下行，利尿通淋。上三味藥對(duì)于氣、血、濕濁多有通利作用，以針對(duì)本病在標(biāo)之氣滯、血瘀、濕濁為患。諸藥配伍，標(biāo)本兼治。

作為中藥對(duì)照組的痛風(fēng)舒片，主要藥物為大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己，功用清熱、利濕、解毒，治標(biāo)為主，雖祛邪但由于不能扶正，忽略了腎臟虧虛之本，所以療效有限。臨床中常用的治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的西藥是秋水仙堿，其消炎止痛作用顯著，但是副作用較大，尤其是胃腸道反應(yīng)。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作機(jī)制十分復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為:高尿酸血癥狀態(tài)易形成尿酸鹽結(jié)晶，作為異物觸發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)及周圍組織的急性炎癥反應(yīng)。hs-CRP是一種炎癥因子，是反映機(jī)體炎癥過程的靈敏指標(biāo)[6]?，F(xiàn)代研究表明，血清中hs-CRP含量在風(fēng)濕性疾病時(shí)會(huì)升高，升高的原因在于炎癥反應(yīng)和組織損傷，且hs-CRP水平與其損傷程度成正比[7]。劉國生等[8]的研究表明，血清中hs-CRP水平對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作與轉(zhuǎn)歸具有一定的相關(guān)性，可作為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎診療的一項(xiàng)新指標(biāo)。另外，Wnt pathway在骨與關(guān)節(jié)形成和破壞中通過幾個(gè)抑制性的分泌型分子起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，DKK-1是其中最重要的抑制劑[9]。趙衛(wèi)等[10]的研究結(jié)果表明，血清中的尿酸和沉積于骨組織中的尿酸鹽共同作用導(dǎo)致骨破壞，DKK-1是參與原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎骨破壞的重要因子之一。由于研究較少，DKK-1在急性期痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎期的表達(dá)特點(diǎn)尚有爭論。

本實(shí)驗(yàn)通過測定各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量，證實(shí)補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方能降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血hs-CRP的表達(dá)，從而緩解紅、腫、熱、痛等炎癥癥狀；對(duì)Wnt途徑抑制劑DKK-1的表達(dá)具有一定抑制作用，有減少軟骨及骨質(zhì)破壞的可能性。這可能是補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎眾多機(jī)制中的一種。但是，由于有關(guān)DKK-1在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中的具體表達(dá)過程尚不是十分明確，補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方對(duì)其作用不太明確的原因仍需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 張眾.中西藥聯(lián)用治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型原發(fā)性急性痛風(fēng)36例臨床研究.江蘇中醫(yī)藥，2011，43（6）：30

[2] 中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的通知 [EB/OL].[2006-09-30]http：//www.most. gov.cn/fggw/zfwj/zfwj2006/200609/t20060930_54389.htm

[3] 王俊霞，韓潔茹，周雪明.姜德友從腎論治痛風(fēng)經(jīng)驗(yàn).上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（2）：16

[4] 姜德友，安偉濤，謝穎，等.補(bǔ)腎利濕法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效觀察.新中醫(yī)，2012，44（10）：35

[5] 沈映君.中藥藥理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：433

[6] 胡艷立，朱偉斌.血清超敏C反應(yīng)蛋白對(duì)痛風(fēng)的診斷價(jià)值.海南醫(yī)學(xué)，2012，23（3）：95

[7] He P，Xie XH，Ding YP，et al.Correlation between high sensitive C-reactive protein，lipoprotein（a），blood uric acid and severity of coronary artery disease.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90（28）：1989

[8] 劉國生，周發(fā)為，唐生堯，等.超敏C反應(yīng)蛋白在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎診療中的價(jià)值.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版），2014，31（3）：22

[9] Miller JR.The Wnts.Genome Biol，2002，3（1）：3001

[10] 趙衛(wèi)，高輝，朱佳鑫，等.血清Dickkopf-1與原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎骨破壞的相關(guān)性.北京大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版），2012，44（2）：254

R289.7

A

1672-397X（2015）07-0077-03

姜德友（1960—），男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事經(jīng)方治療疑難雜癥與龍江醫(yī)派研究。

陳飛，醫(yī)學(xué)博士。chenfei0622@126. com

2015-04-30

編輯：吳 寧

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173170）