月月紅月季體細(xì)胞胚胎植株再生關(guān)鍵技術(shù)研究

陳彥斌，劉 蓉，蔡冬元，陳己任

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410127）

月月紅月季體細(xì)胞胚胎植株再生關(guān)鍵技術(shù)研究

陳彥斌1，劉 蓉2，蔡冬元2，陳己任1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410127）

以帶1mm葉柄的月季葉片為外植體誘導(dǎo)出胚性愈傷和體細(xì)胞胚胎，對月季體細(xì)胞胚胎植株再生進行研究。結(jié)果表明，月季體細(xì)胞胚胎再生與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基坡度和體細(xì)胞胚胎自身類型等密切相關(guān)。月季體細(xì)胞胚胎在S P/R培養(yǎng)基（含1.0Mg/L 6-BA＋0.05Mg/L N AA＋3.0 Mg/L G A3）上比在EM培養(yǎng)基（含1.0Mg/L 2,4-D+0.1Mg/L T DZ）上能再生出更多小植株,在E P培養(yǎng)基（含3.0Mg/L 2,4-D+0.5Mg/L T DZ）上則逐步褐化死亡；將培養(yǎng)基放置成坡面，有利于體細(xì)胞胚胎分化出芽和根，提高植株再生率；在體細(xì)胞胚胎的子葉尚未完全開張（呈90°～150°角）前轉(zhuǎn)入傾斜的S P/R培養(yǎng)基可以再生出正常植株，體細(xì)胞胚胎子葉充分伸展甚至向外翻轉(zhuǎn)時（大于150°角）再轉(zhuǎn)入傾斜的S P/R培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚胎則會回到愈傷組織形態(tài)，喪失植株再生能力。

月季；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；植株再生；培養(yǎng)基

1967年，Hill報道了現(xiàn)代月季離體培養(yǎng)可成功誘導(dǎo)器官再生[1]，自此以后，有關(guān)月季植株離體再生培養(yǎng)的報道越來越多。月季植株再生的途徑很多，其中以不定芽為材料誘導(dǎo)器官發(fā)生獲得再生植株的報道較多。例如：高莉萍和包滿珠分別采用直接和間接法誘導(dǎo)不定芽，建立了現(xiàn)代月季——薩曼莎的再生體系[2]；張常青等[3]以地被月季Royal Bassino為材料建立了不定芽高頻再生體系；孟令寧等[4]建立了大花香水月季間接器官再生途徑；田傳衛(wèi)等[5]建立了多花薔薇假珠芽再生體系。另外，通過誘導(dǎo)月季體細(xì)胞胚胎發(fā)生也是獲得再生植株的有效途徑之一。例如：郭艷超等[6]通過誘導(dǎo)香水月季類原球莖獲得了再生植株；郭麗娟等[7]以豐花月季品種——紅帽子的葉片為材料，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得了再生植株；尤揚等[8]以黃和平月季的幼嫩葉片為材料誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得了再生植株。鑒于月季在觀賞園藝以及香味物質(zhì)制作中的重要地位，法國、美國、韓國、日本等國的月季體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研究較多[9-15]。從前人的研究成果不難看出，通過離體培養(yǎng)獲取月季再生植株并不容易，尤其是通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲取再生植株的頻率較低[16-17]。

中國月季栽培種——月月紅的花大色紅，觀賞價值較高，在月季育種中占據(jù)重要地位，是現(xiàn)代月季始祖之一[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH值、ABA含量和光質(zhì)3個條件對月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體細(xì)胞胚胎類型有顯著影響；同時，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生向器官發(fā)生轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)了介于體細(xì)胞胚胎和芽的中間態(tài)，這說明體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生可能是同源的[19-20]；另外，研究還發(fā)現(xiàn)月月紅的植株再生不穩(wěn)定，再生率的高低與外界條件和自身形態(tài)密切相關(guān)，以雙子葉型體細(xì)胞胚胎的再生率最高[21]。由于體細(xì)胞胚胎再生為植株是影響基因轉(zhuǎn)化、良種擴繁的關(guān)鍵技術(shù)，試驗主要對培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚胎形態(tài)等影響體細(xì)胞胚胎植株再生的主要因素進行研究，以期進一步優(yōu)化中國月季的體細(xì)胞胚胎植株再生體系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試月季品種為月月紅（Rosa.chinensis Jacq.），采自北京林業(yè)大學(xué)苗圃，以帶1mm葉柄的月季葉片為外植體。

供試培養(yǎng)基有SP/R培養(yǎng)基（MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋GA33.0mg/L＋瓊脂0.6%，pH值6.0），用于芽分化或再生；EP培養(yǎng)基（SH＋蔗糖3%＋L-脯氨酸300mg/L＋瓊脂0.4%＋2,4-D 3.0 mg/L＋TDZ 0.5mg/L，pH值5.4），用于胚胎分化；EM培養(yǎng)基（SH＋2,4-D 1.0 mg/L＋TDZ 0.1 mg/L＋ABA 1.0 mg/L＋GA33.0 mg/L＋蔗糖 3%＋瓊脂0.4%，pH值6.0），用于胚胎成熟。白光由實驗室白色熒光燈管Philips TLP 36W/840提供；紅光由Philips 13W MiniTwister Energy SaverRed bulbs提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 將植株表面消毒后，取長0.5～0.8 cm、帶約1mm葉柄的葉片置于優(yōu)化的EP培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿密封后置于暗處培養(yǎng)，每4周更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2 胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生 將EP培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周的胚性愈傷轉(zhuǎn)移到EM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。光照條件為紅光，光強約為7.2 μmol（/m·s）。每4周更換一次培養(yǎng)基。

1.2.3 體細(xì)胞胚胎的植株再生 設(shè)計3個體細(xì)胞胚胎植株再生方案：（1）胚性愈傷組織在EM培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周后，選擇可見子葉胚的愈傷組織，連同體細(xì)胞胚胎一同轉(zhuǎn)到新的EP、EM和SP/R培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎植株再生，每瓶稱取可見子葉胚的愈傷組織1 g，每個處理10瓶；（2）用SP/R培養(yǎng)基制備水平和坡面兩種固體培養(yǎng)基，水平培養(yǎng)基用普通玻璃培養(yǎng)瓶，坡面培養(yǎng)基用250ML三角瓶，趁熱倒入約20ML SP/R培養(yǎng)基，先將三角瓶傾斜放置，使培養(yǎng)基表面幾乎與瓶底垂直；各挑選30個子葉胚分別放置于兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基上放置10個左右，觀察其植株再生情況；（3）選取兩種不同開張度的“雙子葉”型體細(xì)胞胚胎，一種是子葉開張度為90°～150°，另一種是子葉呈外卷狀，開張度大于180°；兩種開張度分別選10個，置于坡面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其再生過程；體細(xì)胞胚胎植株再生的培養(yǎng)條件相同，為溫度25 ±2°C，光照周期為16 h/8 h（L/D），白光照射，光強約為27.0μmol（/m·s），于8～12周觀察體細(xì)胞胚胎植株再生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對體細(xì)胞胚胎植株再生的影響

對帶子葉胚的胚性愈傷在EP、EM、SP/R上的分化和再生情況進行了研究，結(jié)果表明，在EP培養(yǎng)基和EM培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)12周后，部分外植體的葉柄基部逐漸分化出胚性愈傷組織，并分化出帶子葉的體細(xì)胞胚（圖1A）。將這些帶子葉胚的胚性愈傷組織分別置于EP、EM和SP/R培養(yǎng)基上，在1～3周，有些體細(xì)胞胚胎會進一步分化，伸長子葉，并長出芽。隨后，EP培養(yǎng)基上的愈傷組織開始逐漸褐化并死亡（圖1Ba）；EM培養(yǎng)基上的愈傷組織也有一定程度的褐化，但能再生出少量正常植株，每克愈傷組織約可以分化出再生植株1～3株（圖1Bb）；在EP、EM培養(yǎng)基上的愈傷組織會繼續(xù)分化出愈傷組織，增加愈傷組織的量；SP/R培養(yǎng)基上的愈傷組織不再增加，原來的愈傷組織逐步分化和再生出正常植株，每克愈傷組織約可以分化出再生植株5～9株（圖1Bc）。

圖1 胚性愈傷體細(xì)胞胚胎發(fā)生和在不同培養(yǎng)基上植株再生A為在EM培養(yǎng)基上分化出的體細(xì)胞胚胎；B為胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚胎在E P（a）、EM（b）和S P/R（c）培養(yǎng)基上的再生情況。

2.2 培養(yǎng)基坡度對植株再生的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚胎從愈傷組織上脫離下來后，在很長一段時間內(nèi)不會生長，多數(shù)會伸長子葉柄；常規(guī)培養(yǎng)時，培養(yǎng)基表面會聚集一些水份，芽點長期浸在培養(yǎng)基表面的水中較難萌發(fā)，逐漸長成水漬狀，失去生長活力（圖2A）。而將培養(yǎng)基做成與瓶底幾乎垂直的坡面，培養(yǎng)基表面的水分下溢，體細(xì)胞胚胎置于坡面培養(yǎng)基的中間位置，可以像種子胚一樣正常生長。子葉先膨大，然后長出芽和根（圖2B）。對比發(fā)現(xiàn)，在平面培養(yǎng)基上，雙子葉型體細(xì)胞胚胎的植株再生率只有20%，而在坡面培養(yǎng)基中植株再生率達到63.3%。

圖2 脫離愈傷組織的體細(xì)胞胚胎在水平和坡面培養(yǎng)基上的分化與植株再生A為脫離愈傷組織的體細(xì)胞胚胎在水平S P/R固體培養(yǎng)基上生長8周的狀態(tài)；B為脫離愈傷組織的體細(xì)胞胚胎在坡面S P/R固體培養(yǎng)基上生長1周（a）、2周（b）、7周（c）、9周（d）的狀態(tài)。

2.3 子葉開張角度對植株再生的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，不同光照條件和不同激素濃度對月季體細(xì)胞胚胎的形態(tài)特征均有影響。不同ABA含量可使月季分化出單子葉、雙子葉甚至多子葉型體細(xì)胞胚胎。其中，以雙子葉體細(xì)胞胚胎的再生頻率最高。研究進一步發(fā)現(xiàn)，子葉的開張角度對植株再生也有顯著影響。通過對開張角度較小和開張角度較大的兩組雙子葉型體細(xì)胞胚胎的觀察發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚胎子葉開張角度較小，在90°～150°時，可以清楚地看到子葉中間有小孔（圖3Aa），能分化出正常芽；當(dāng)子葉開張角度大于180°時，子葉逐漸外卷，兩片子葉中間沒有小孔（圖3Ba）。在坡面培養(yǎng)基上，子葉開張角度較小的體細(xì)胞胚胎的子葉先膨大，并分化出根尖，然后分化出芽點，并迅速生長出芽（圖3Ab和c）。子葉開張角度較大且子葉外卷的體細(xì)胞胚胎則不一樣，它在轉(zhuǎn)入坡面培養(yǎng)基后，首先會在芽點位置和根尖點位置繼續(xù)長出愈傷組織，隨后整個子葉也會長出愈傷組織，完全喪失植株再生能力（圖3Bb和c）。

圖3 不同開張度體細(xì)胞胚胎在坡面培養(yǎng)基上的分化A為子葉開張角度在90°～150°的體細(xì)胞胚胎在坡面培養(yǎng)基上像種子胚一樣正常分化出芽；B為子葉開張角度大于180°的體細(xì)胞胚胎在坡面培養(yǎng)基上會逐步分化成愈傷組織。

3討論

月季的體細(xì)胞胚胎和器官發(fā)生已有很多報道，但從文獻的連續(xù)性報道分析，絕大多數(shù)研究者都在做完體細(xì)胞胚胎發(fā)生以后，未進行后續(xù)的如轉(zhuǎn)基因方面的研究，主要原因是月季從體細(xì)胞胚胎到植株再生這一過程的條件非?？量蹋偕实?，一般在3%左右，最高的也只有35%左右。晏慧君等[22]以月月紅為材料進行植株再生，再生率僅0.15%～0.48%。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，如果不對月季的體細(xì)胞胚胎進行分類，去除不能再生的胚，不嚴(yán)格和正常掌握轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基的時間，月月紅的植株再生率可能還會更低。這嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因等新技術(shù)在月季種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用。

該研究結(jié)果表明，首先，以2,4-D誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生，當(dāng)體細(xì)胞胚胎子葉形成后要及時替換成不含2,4-D的培養(yǎng)基，如果未及時替換，芽點和根尖點會進一步脫分化成愈傷組織，很難再生出植株；其次，體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，根點和芽點不宜長期浸漬在水分和液體營養(yǎng)中，將培養(yǎng)基做成坡面，甚至與瓶底成垂直狀態(tài)可有效避免水漬狀細(xì)胞產(chǎn)生，有利于芽點和根尖點進一步分化成再生植株。關(guān)于激素和水分營養(yǎng)梯度對月季體細(xì)胞胚胎植株再生所起的作用及機理有待進一步深入研究。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Key Technologies for Plant Regeneration of Somatic Embryos in Rose‘Yueyue Hong’（Rosa chinensis Jacq.）

CHEN Yan-bin1，LIU Rong2，CAIDong-yuan2，CHEN Ji-ren1
（1.College of Horticulture and Gardening,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC; 2.Hunan Biological and Professional technology College,Changsha 410127,PRC）

Leavesw ith a 1mMpetiole of China Rose(R.chinensis Jacq.)were used asexplant to induce embryogenic callus and embryos for study of p lant regeneration of rose.The results show ed that the regeneration of rose somatic embryos was closely related to types of culturemedia,slope ofmediuMand type of embryo itself.The higher regenerated frequency w as obtain on SP/R mediuMcontaining 1.0 mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LGA3than on EMmediuMw ith 1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ.Somatic embryoson EPmedia w ith 3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZwould be browned and subsequently necrosed.The sloping and even verticalmedium,w ith probably differentw ater and nutrition level in differentmediuMheight,was benefit for the proliferation of shoot and root of somatic embryos and showed higher regenerated frequency.Somatic embryos should be transferred to SP/RmediuMfor normal plant regeneration before the cotyledons stretch thoroughly.The somatic embryo w ith cotyledons stretch thoroughly would go back to calli and lose capacity of regeneration on SP/Rmedium.

rose;somatic embryogenesis;plant regeneration;medium

S685.12

A

1006-060X（2015）04-0091-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.029

2015-04-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（31272208，31071826）；湖南省研究生創(chuàng)新基金資助項目（C X2012B298,X C X13101）

陳彥斌（1988-），男，湖南湘潭市人，碩士研究生，主要從事園藝植物栽培與育種研究。

陳己任