懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍細菌對鹽堿脅迫的生理應(yīng)答研究

郭金英，朱蓓茹，吳 影，任國艷，王 萍，崔國庭，張玉先，馮惠敏

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023

發(fā)狀念珠藍細菌主要分布于我國北部和西北部的干旱和半干旱地區(qū)，這一地區(qū)存在著大面積既含有中性鹽(Na2SO4)又含有堿性鹽(Na2CO3)的鹽堿化土壤，大部分耕作層土壤鹽含量在0.78%～1.68%［1］，鹽堿影響著作物的生長。發(fā)狀念珠藍細菌是具有生長優(yōu)勢的固氮生物，可為其它土壤微生物的生長提供碳源和氮源，是荒漠化土壤中的“先鋒生物”，具有極強的耐旱、耐堿、耐高溫等能力。因而，發(fā)狀念珠藍細菌在我國西部環(huán)境治理和生態(tài)恢復(fù)方面，具有特殊的地位和重要的生態(tài)學(xué)意義。畢永紅等對天然發(fā)狀念珠藍細菌藻體進行不同濃度的鹽脅迫處理，指出鹽脅迫下天然發(fā)狀念珠藍細菌正常生理活性受到抑制而表現(xiàn)出一定的抗逆能力，發(fā)狀念珠藍細菌對鹽脅迫具有一定的耐受性，添加外源硝酸鹽后有助于緩解發(fā)狀念珠藍細菌細胞培養(yǎng)物的鹽脅迫，提高其抗鹽性［2-4］。本研究以懸浮培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藍細菌細胞為材料，研究鹽堿脅迫下懸浮發(fā)狀念珠藍細菌細胞質(zhì)膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白以及可溶性多糖含量的變化，探討液體懸浮培養(yǎng)下發(fā)狀念珠藍細菌細胞對鹽堿脅迫的響應(yīng)，認識懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍細菌對鹽堿脅迫的適應(yīng)性，指導(dǎo)發(fā)狀念珠藍細菌的人工培養(yǎng)，具有重要的理論意義和實踐價值。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)狀念珠藍細菌種(Nostoc flagelliforme)由工業(yè)微生物教育部重點實驗室提供，本實驗室分離純化后擴大培養(yǎng)。經(jīng)活化后無菌條件下4000 rpm 離心10 min，收集離心后細胞，重新懸浮于新鮮的BG-11液體培養(yǎng)基中。

1.2 鹽堿脅迫處理

離心收集分離純化后的發(fā)狀念珠藍細菌細胞5 mL，無菌條件下，分別接種于含體積比1∶1 混合的Na2SO4和Na2CO3(0、60、120、180、240 mmoL/L)的100 mL BG-11 培養(yǎng)基中，25 ℃，80 μmol/(m2·s)光照強度下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h 和72 h，以不加鹽堿的空白組為對照，進行測定，每種處理做3 組平行。

1.3 質(zhì)膜透性測定

參照李合生［5］的方法，稱取離心后不同處理的發(fā)狀念珠藍細菌細胞各2 g，放入燒杯中，加入20 mL 去離子水，25 ℃下靜置10 h。用玻璃棒輕輕攪拌均勻，恒溫下用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率。再將試管放入100 ℃沸水中恒溫水浴15 min，待其冷卻至25 ℃時，恒溫測定煮沸液電導(dǎo)率。

電解質(zhì)相對滲透率(%)=(處理液電導(dǎo)率值/煮沸液電導(dǎo)率值)×100%

1.4 丙二醛(MDA)含量測定

參照Tsarouhas［6］的方法，取0.5 g 發(fā)狀念珠藍細菌細胞加5 mL 50 mM(pH 7.8)磷酸緩沖勻漿，4000 rpm 離心取上清液1 mL，加2.5 mL 0.6% TBA(硫代巴比妥酸)溶液混勻，加塞，沸水浴15 min，迅速冷卻，離心，取上清液分別測定其在532、600、450 nm 波長處的吸光度。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性測定

參照王星［7］的方法，取0.5 g 發(fā)狀念珠藍細菌細胞加5 mL50 mM(pH7.8)磷酸緩沖勻漿，13000 rpm 4 ℃離心10 min，上清液即為酶提取液。取透明度好的干凈試管，按表1 加入各溶液組分。

表1 SOD 反應(yīng)液Table 1 The component of SOD reaction mixture

混勻后將2 支對照管置暗處做空白對照，其余各管于80 μmol/(m2·s)光下反應(yīng)25 min，反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管為空白，測OD560值。SOD酶活性以抑制NBT 光化學(xué)反應(yīng)的50%為一個酶活性單位(U)，計算SOD 酶活性。

1.6 脯氨酸(Pro)含量測定

采用酸性茚三酮法［8］。準(zhǔn)確稱取離心后的發(fā)狀念珠藍細菌細胞0.5 g，加入5 mL 3%的磺基水楊酸勻漿，放入具塞試管內(nèi)，沸水水浴浸提10 min;不斷震蕩搖動，冷卻，3000 rpm 離心10 min 后靜置，上清液即為提取的脯氨酸溶液。取2 mL 提取液加入2 mL 冰醋酸和4 mL 酸性茚三酮，沸水浴60 min，溶液為紅色，冷卻后加入4 mL 甲苯，震蕩30 s，靜置片刻，吸取上層紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，測OD520值。

1.7 可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法［9］。取上述SOD 提取液1 mL 加5 mL 考馬斯亮藍后搖勻，放置2 min 后，以蒸餾水做空白，595 nm 比色，測OD595。

1.8 可溶性多糖含量測定

采用蒽酮比色法。稱取不同處理的發(fā)狀念珠藍細菌細胞0.5 g，加入5 mL 10%的TCA 勻漿后浸泡，離心，取上清液1 mL 加5 mL 蒽酮，沸水中煮10 min，流水冷卻，冷卻后在室溫下靜置10 min，以80%乙醇調(diào)零，測定626 nm 波長處的吸光度。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞膜透性的影響

由圖1 可以看出:隨著鹽堿脅迫濃度的增大，細胞外滲率先是迅速增加，后逐漸趨于平穩(wěn)，細胞膜受到嚴重傷害，外滲率達到80%以上。脅迫時間越長，細胞膜受到的傷害越嚴重;比較鹽堿脅迫24 h和72 h 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脅迫72 h 較24 h 同期高出約13%。

圖1 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞外滲率的影響Fig.1 Effect of salinity-alkalinity on electrolyte leakage of N.flagelliforme cell

2.2 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞MDA 含量的影響

圖2 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞MDA 含量的影響Fig.2 Effect of salinity-alkalinity on MDA content of N.flagelliforme cell

由圖2 可以看出，隨著鹽堿濃度增加和時間延長，MDA 含量呈不斷上升的趨勢，與對照相比，差異極顯著(P＜0.01);高濃度的鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞的傷害程度更大，鹽堿濃度為240 mmol/L 時MDA 的增加量約是60 mmol/L 下增加量的7 倍;隨著鹽堿濃度的增加，24 h 脅迫下MDA 含量的增加明顯較72 h 脅迫下平緩得多，表明時間越長，鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞膜脂過氧化程度的傷害越大。

2.3 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞SOD 酶活性的影響

SOD 作為超氧自由基清除劑，其活性與生物體抗逆性大小有一定的關(guān)系，在適度的逆境誘導(dǎo)下，SOD 活性增加以提高生物體的適應(yīng)能力。圖3 所示，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，SOD 活性先上升后下降，然后逐漸趨于平穩(wěn)，在脅迫濃度為120 mmol/L 時達到最大值;比較鹽堿脅迫不同時間發(fā)狀念珠藍細菌細胞的SOD 活性發(fā)現(xiàn)，24 h 和72 h 脅迫趨勢基本相同。

圖3 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞SOD 酶活性的影響Fig.3 Effect of salinity-alkalinity on SOD activity of N.flagelliforme cell

2.4 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞脯氨酸含量的影響

圖4 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of salinity-alkalinity on Pro content of N.flagelliforme cell

脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，含量升高時，不僅有利于吸收水分，保持水分，同時可以對細胞內(nèi)的一些酶類起到保護作用。由圖4 可以看出，24 h 和72 h 脅迫過程中發(fā)狀念珠藍細菌細胞脯氨酸含量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。脅迫24 h，120 mmol/L 時達到最大值，最大增加量為0.7 μg/g;脅迫72 h，60 mmol/L 時達到最大值，最大增加量為0.9 μg/g。表明，脯氨酸與發(fā)狀念珠藍細菌細胞的抗鹽堿性之間并沒有明顯的直接關(guān)系，僅在濃度較低時，小于60 mmol/L 時起到一定的保護作用，但影響較小，表明在鹽堿脅迫下，發(fā)狀念珠藍細菌細胞幾乎不受脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)保護作用。

2.5 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可知，隨著鹽堿濃度的增大，發(fā)狀念珠藍細菌細胞中的可溶性蛋白含量呈下降趨勢，72 h 脅迫后可溶性蛋白含量顯著下降，這可能是由于鹽堿脅迫使得發(fā)狀念珠藍細菌細胞受到離子毒害作用，導(dǎo)致發(fā)狀念珠藍細菌細胞中蛋白質(zhì)的分解，同時也說明了鹽堿脅迫作用下，發(fā)狀念珠藍細菌細胞中的可溶性蛋白沒有發(fā)揮有效的保護作用。

圖5 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of salinity-alkalinity on soluble protein content of N.flagelliforme cell

2.6 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞可溶性多糖含量的影響

圖6 鹽堿對發(fā)狀念珠藍細菌細胞可溶性多糖含量的影響Fig.6 Effect of salinity-alkalinity on soluble polysaccharide of N.flagelliforme cell

可溶性多糖作為發(fā)狀念珠藍細菌細胞中主要的還原性糖，與其抗逆性有很大關(guān)系。在發(fā)狀念珠藍細菌細胞的鹽堿脅迫過程中，隨著鹽堿濃度的增加，可溶性多糖含量持續(xù)上升(圖6)，且發(fā)狀念珠藍細菌細胞脅迫24 h 受到可溶性多糖的保護明顯多于脅迫72 h。

3 討論

發(fā)狀念珠藍細菌因生存環(huán)境獨特，長期適應(yīng)環(huán)境，使其結(jié)構(gòu)和生理生化發(fā)生了不同程度的變化。在鹽堿脅迫環(huán)境條件下，發(fā)狀念珠藍細菌膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了適應(yīng)性變化。隨鹽堿度的增加，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率不斷上升，質(zhì)膜透性不斷增大。電解質(zhì)外滲率直接表示了細胞膜透性的變化，反映出逆境中細胞膜的受損程度。膜脂的過氧化作用是破壞細胞膜系統(tǒng)的重要原因之一，電解質(zhì)的不斷外滲，改變了細胞的內(nèi)環(huán)境平衡［10］，這種平衡的破壞導(dǎo)致氧自由基在膜脂表面積累，MDA 作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量隨著鹽堿度的上升而增長，間接反映了這些活性氧簇的積累對細胞膜的過氧化損傷的加劇，這與焉婷婷等［11］的報道一致。

生物體內(nèi)酶活性的改變是細菌抗鹽堿脅迫的機制之一。SOD 能夠有效的清除體內(nèi)的超氧自由基，在多種環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要的保護作用［12］。鹽堿脅迫處理過程中，SOD 酶活性表現(xiàn)為先上升后下降，表明SOD 在一定程度上對發(fā)狀念珠藍細菌細胞起到了保護作用。曹特［13］對金魚藻抗氧化酶活力測定結(jié)果表明，硝酸鹽處理下SOD 和CAT 活性在24 h 時才有明顯升高;銨鹽處理下CAT 活性變化最大，在5～15 h 時其活性與處理濃度正相關(guān)，更長時間24 h 處理則導(dǎo)致響應(yīng)停止。一些藍藻細胞如螺旋藻［14］和鹽生隱桿藻［15］進行鹽脅迫處理后也得到了相似的結(jié)論。

綜合本研究結(jié)果，在研究的鹽堿濃度范圍內(nèi)，發(fā)狀念珠藍細菌細胞SOD 在一定程度上對發(fā)狀念珠藍細菌細胞起到了保護作用，可溶性糖積累調(diào)節(jié)了細胞滲透勢，保護了細胞膜的完整性，減少了細胞傷害。

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