羊蹄葉過氧化物酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究

黃國文

湖南科技學(xué)院生命科學(xué)和化學(xué)工程學(xué)院，永州 425199

羊蹄(Rumex japonicusHoutt)生于山野、路旁、濕地，在我國分布廣泛，是多年生蓼科酸膜屬野生草本植物，生長茂盛，花期3～4月，果期5～6月，可作野菜食用和藥用。過氧化物酶(POD)存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，是一類以血紅素為輔基的氧化還原酶，一般含有Fe 和Cu 等金屬離子，催化由過氧化氫參與的多種物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)。在植物中參與生長素代謝，調(diào)節(jié)細胞壁的生物合成，調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育［1］;參與植物的抗性，包括抗干旱、抗鹽堿、抗病等機能，是植物的重要保護酶之一。在植物抗病過程中，過氧化物酶積極作用，產(chǎn)生大量活性氧來抑制和殺死入侵的病菌。同時，它可使O2、H2O2等轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，消除植物體內(nèi)生物氧化產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，使植物組織及細胞得到保護［2］;也參與果實的褐變過程，催化酚類物質(zhì)、谷胱甘肽、抗壞血酸的氧化，使果皮變色。在生產(chǎn)實踐上，外源過氧化物酶能夠促進植物的生長［3］，用于酚類廢水的處理［4］和酶聯(lián)免疫檢測［5］。本文采用磷酸緩沖液浸提法研究羊蹄葉中過氧化物酶的提取工藝條件及其酶學(xué)性質(zhì)，為理解羊蹄植物的生長特性和酶學(xué)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

湖南科技學(xué)院周圍田間生長茂盛的羊蹄葉片。本材料對照中國高等植物圖鑒［6］和中國植物志［7］中種的描述進行識別認定。

1.1.2 主要儀器

電子天平(津島儀器)，722B 型分光光度計(上海析譜儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(天津比朗實驗儀器制造有限公司)。

1.1.3 主要試劑

愈創(chuàng)木酚、H2O2、Na2HPO4、Na2HPO4、NaOH、HCl 等為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 羊蹄葉POD 浸提條件研究

1.2.1.1 提取羊蹄葉POD 的單因素實驗

以0.02 mol/L 磷酸緩沖液pH 9 為提取液，浸提時間為30 min，浸提溫度為35 ℃，料液比為1∶10為提取酶一次的條件，變動其中的因素:料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，0.02mol/L 磷酸緩沖液pH 為8、9、10、11、12，溫度為20、25、30、35、40℃，浸提時間為15、30、45、60 和75 min 來提取和測定浸出酶活性，確定適合浸提因素。

1.2.1.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗確定的條件，通過L9(34)正交實驗得出最佳浸提條件。

1.2.2 酶活性和蛋白質(zhì)含量測定方法

用愈創(chuàng)木酚作為底物的比色法［8］測定提取液的POD 活性。以每克材料提取的POD 在每分鐘內(nèi)A470 增加0.01 為1 個酶活性單位(U)。用雙縮脲法［9］測定提取液的蛋白質(zhì)含量，以小牛血清蛋白制作蛋白標準曲線為Y=0.2282X-0.0008，R2=0.9993。

1.2.3 酶的純化

1.2.3.1 pH 沉淀

在最佳條件下提取羊蹄葉片的蛋白質(zhì)溶液，用稀鹽酸調(diào)pH 成2、3、4、5、6，在冰水中放置半小時，4000 rpm 離心20 min，收集沉淀，用等量的pH9 的磷酸緩沖液溶解后測定酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算比活力。比活力等于酶活性除以蛋白質(zhì)重量(mg)。

1.2.3.2 丙酮沉淀

取最佳pH 沉淀的蛋白經(jīng)過透析后加入0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 體積預(yù)冷(-20 ℃)的丙酮，-20 ℃冰箱中靜置90 min，低溫離心去沉淀，通過冷凍干燥去除丙酮，沉淀用等體積磷酸緩沖液溶解，測定蛋白含量和酶活性，計算比活力。另外，測定各階段酶的純度、純化倍數(shù)和酶活性回收率。其中過氧化物酶純度用Rz 值表示［10］，Rz 值=A403/A280，A403代表血紅素輔基的吸收，A280代表蛋白質(zhì)的吸收;純化倍數(shù)是酶純化過程中每個步驟獲得酶的比活力與粗酶液中酶比活力的比值;酶活回收率是每個純化步驟中的酶活性與粗酶液的酶活性的比值百分數(shù)。

1.2.4 一些化合物對酶活性的影響

在測定酶活性的反應(yīng)體系中分別添加CuSO4、ZnSO4、MgSO4、CaCl2、KCl、NaCl 至終濃 度6.26、12.5、25、50、100、200、400、800 mmol/L，以煮沸的酶作為對照，測定酶活性，考察其對POD 活性的影響。

1.2.5 POD 米氏常數(shù)的測定

取0.04%過氧化氫0.25、0.5、1、1.5、2 mL，分別放入5 個干凈的試管中，配制測定酶活性方法反應(yīng)體系，體系中過氧化氫濃度分別為0.59、1.18、2.35、3.53、4.71、5.88(×10-3)mmol/L，測定酶的反應(yīng)速度。取0.25、0.5、1、1.5、2.0 mL 濃度為0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚放入5 個干凈的試管中，用磷酸緩沖液補足到3.9 mL，分別加入1.0 mL 2% H2O2和0.1 mL 酶液，配制的愈創(chuàng)木酚濃度分別為2.5、5、10、15、20 mmol/L，然后測定POD 的反應(yīng)速度，用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk 法)，計算Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊蹄葉POD 提取條件的研究

2.1.1 料液比對POD 活性的影響

料液比是影響酶浸出的一個重要因素(圖1A)，料液比為1∶30 時POD 的活性最大，過高或者過低酶的活性較小，這可能是料液比影響酶成分的浸出和穩(wěn)定。因此選擇1∶30、1∶40 和1∶50 作為料液比作為優(yōu)化條件。

2.1.2 提取液pH 對POD 活性的影響

提取液pH 對POD 浸出有較大影響(圖1B)。在提取液pH9 時POD 活性最大，說明溶液pH 影響酶的溶出和活性，因此選擇選擇提取液pH 為8、9和10。

2.1.3 浸提溫度對POD 活性的影響

浸提溫度對酶活性有較大影響(圖1C)，35 ℃時POD 活性最高，溫度過低和過高酶活性較小，說明溫度過低會影響酶的浸出，溫度過高會引起酶的變性而失活。因此浸提溫度可以選擇30、35 和40℃作為優(yōu)化條件。

2.1.4 浸提時間對POD 活性的影響

材料浸泡時間的長短會影響酶的浸出和活性。浸提時間在30 min 時POD 活性最大(圖1D)，浸泡材料超過30 min 以后POD 活性減小，說明在35 ℃保溫較長時間酶的穩(wěn)定性降低，要么變性要么降解，因此選擇15、30、45min 作為優(yōu)化條件。

圖1 料液比(A)、提取液pH(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)對羊蹄葉POD 活性的影響Fig.1 Effects of ratio of material to buffer (A)，buffer pH (B)，extraction temperature (C)and extraction duration (D)on the activity of PODs from R.japonicas leaves

2.1.5 正交實驗

根據(jù)料液比、提取液pH、浸提溫度、浸提時間這四個單因素實驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗L9(34)，以浸出的POD 活性為指標，結(jié)果和分析見表1。由極差分析可知，這四個因素對POD 活性影響的程度依次是浸提時間＞浸提溫度＞提取液pH ＞料液比，最優(yōu)水平組合為料液比為1∶40，提取液pH 為9，浸提溫度是35 ℃，浸提時間為30 min。

表1 羊蹄葉POD 提取的正交實驗結(jié)果和分析Table 1 L9(34)experimental results and analysis of extracting PODs from R.japonicus leaves

2.2 pH 沉淀對羊蹄葉POD 的影響

在最佳條件下提取1 g 羊蹄葉片POD 的溶液。用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)其溶液為酸性pH 值，經(jīng)過離心，收集沉淀測定了蛋白沉淀量，用等體積pH 9 緩沖液溶解沉淀后測定酶的活性(圖2)以及比活力(圖3)，結(jié)果顯示，在pH 為4、5、6 時蛋白沉淀量較高，在pH5 時酶活性最大;酶的比活力可以作為酶純度的度量指標，POD 酶的比活力在pH2、pH3 和pH5 時較大，說明這三種提取液中酶的純度較高，但由于沉淀蛋白質(zhì)的數(shù)量pH5 時較多，重量為1.69 mg，所以調(diào)節(jié)提取液pH 為5 時的沉淀蛋白質(zhì)可以用于進一步純化POD 酶。

圖2 不同pH 影響蛋白沉淀量和酶活性Fig.2 Effects of pH values on protein precipitation amount and enzymatic activity

圖3 不同pH 沉淀的酶比活力Fig.3 The specific activity of POD precipitated by different pHs

2.3 丙酮沉淀對羊蹄葉POD 酶的影響

羊蹄葉1 g 的提取液經(jīng)過pH5 沉淀獲得的蛋白質(zhì)，用pH9 的磷酸緩沖液溶解，-4 ℃透析一夜，透析液中加入不同體積的-20 ℃預(yù)冷的丙酮，放入-20 ℃冰箱中沉淀1.5 h，4500 rpm 離心15 min，收集沉淀，測定蛋白質(zhì)重量，溶解沉淀經(jīng)過透析后測定吸光度的變化，計算酶的活性(圖4)和比活力(圖5)。結(jié)果表明，隨著丙酮體積的增加蛋白質(zhì)沉淀量逐漸增高，POD 活性在1 倍體積的丙酮沉淀后最高，酶的比活性在0.8 和1 倍體積的丙酮沉淀后較高，說明用1 倍和0.8 體積的丙酮分級沉淀的POD 比活力較高，純度較好。

圖4 丙酮調(diào)節(jié)蛋白沉淀量和酶活性Fig.4 Acetone adjusting protein precipitation amount and enzymatic activity

圖5 不同體積的丙酮沉淀的酶比活力Fig.5 The specific activity of POD precipitated by different volumes of acetone

為了研究羊蹄葉POD 酶學(xué)性質(zhì)，大量提取和純化了POD。稱取材料50 g，用200 mL pH9.0 的磷酸緩沖液提取了過氧化物酶的粗酶液。粗酶液依次經(jīng)過pH5.0 沉淀和1 倍體積的丙酮沉淀純化了該酶，純化結(jié)果分析見表2?？芍?，50 克羊蹄葉經(jīng)過pH沉淀和丙酮沉淀后獲得5.3 mg 的過氧化物酶，純化倍數(shù)為4.8，回收率為40.8%;丙酮沉淀比pH 沉淀的酶的純度更高。把丙酮沉淀的過氧化物酶溶解于100 mL pH9.0 的磷酸緩沖液中經(jīng)過透析后用于其酶學(xué)性質(zhì)研究。

表2 羊蹄葉POD 純化過程和結(jié)果分析Table 2 Purification processes and results of PODs from R.japonicus

2.4 一些化合物對酶活性的影響

測定一些化合物對已經(jīng)純化的羊蹄葉POD 活性影響(圖6)。結(jié)果表明:隨著CuSO4濃度的增加，過氧化物相對活性增加，說明CuSO4對羊蹄葉POD活性有激活作用;ZnSO4、MgSO4、CaCl2、KCl、NaCl 等化合物在各種濃度條件下POD 酶活性(小于250U)都低于正常提取條件下的酶活性，說明這些化合物對酶活性有抑制作用。

圖6 一些無機鹽對羊蹄葉POD 活性的影響Fig.6 Effects of inorganic salts on the POD activity in R.japonicas leaves

2.5 POD 米氏常數(shù)的測定

在測定POD 的反應(yīng)體系中，研究H2O2和愈創(chuàng)木酚對POD 的影響。隨著愈創(chuàng)木酚濃度的增加，酶活性增加呈現(xiàn)先上升較快后上升緩慢的曲線(圖7)。以酶活性快速增加的愈闖木酚濃度(2.5～10 mmol/L)，單位時間內(nèi)A470 的變化值作為反應(yīng)速度，用雙倒數(shù)作圖，計算其Km 為0.12 mmol/L。隨著H2O2濃度的增加，酶活性先逐漸增加后逐漸減少(圖8)，說明高濃度H2O2能夠氧化和破壞POD從而抑制酶的活性。以POD 酶活性增加的H2O2濃度(0.59 ×10-3～5.88 ×10-3mmol/L)的倒數(shù)和反應(yīng)速度的倒數(shù)作圖，計算其Km 為0.62 ×10-3mmol/L。POD 以過氧化氫為底物的米氏常數(shù)遠遠小于以愈創(chuàng)木酚為低物的米氏常數(shù)，所以POD 對過氧化氫的親和力遠遠大于對愈創(chuàng)木酚的親和力。

3 討論

圖7 愈創(chuàng)木酚濃度對POD 活性的影響Fig.7 Effects of guaiacol on the POD activity

圖8 H2O2濃度對羊蹄葉POD 活性的影響Fig.8 Effects of H2O2on the POD activity

本文研究了用堿性緩沖溶液提取羊蹄葉中POD 的過程，確定了最佳提取工藝條件。研究了酸性pH 和丙酮沉淀POD 的作用，確定了純化方案，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。目前，已報道的提取植物POD的方法中，采用酸性磷酸緩沖液［11，12］或中性偏堿性磷酸緩沖液［13，14］來抽提POD。根據(jù)自然界中POD的等電點有酸性、中性和堿性［13］，本文用堿性緩沖液提取羊蹄葉POD。通過單因素實驗和正交實驗表明，羊蹄葉POD 的最佳提取條件為料液比為1∶40，提取液pH 為9，浸提溫度是35 ℃，浸提時間為30 min。這些因素對提取POD 的影響程度依次是浸提時間＞浸提溫度＞提取液pH ＞料液比。通過對提取液POD 的純化表明，在調(diào)節(jié)提取液pH5時，沉淀的蛋白質(zhì)量多和酶的比活力大;用丙酮沉淀時，以1 倍體積的丙酮沉淀的POD 的量較多，酶的比活力較大，所以可以用pH5 和1 倍體積的丙酮來純化提取液的POD，用0.8 倍體積丙酮可以進一步純化提取的POD。POD 能催化過氧化氫氧化多種酚類物質(zhì)并形成褐色產(chǎn)物［12］。用不同濃度的愈創(chuàng)木酚與羊蹄葉POD 在常溫、pH9 的條件下反應(yīng)，測得羊蹄葉POD 的Km 值為0.12mmol/L;它比富士蘋果POD 的Km(129.09 mmol/L)［11］數(shù)值小，比冬棗果實POD 的Km(0.2516 mol/L)［15］小很多，說明羊蹄葉POD 氧化酚類物質(zhì)的能力比富士蘋果POD的氧化能力強，比冬棗果實POD 氧化能力更強;用不同濃度的過氧化氫與羊蹄葉POD 在同樣條件下反應(yīng)，測得羊蹄葉POD 的Km 值為0.62 ×10-3mmol/L;它比甘蔗苗POD 的Km(0.038 mol/L)［12］和蓮藕POD 的Km(9 mmol/L)［14］以及蘆薈POD 的Km(34 mmol/L)［16］要小很多，說明羊蹄葉POD 氧化H2O2的能力比蘆薈POD 和甘蔗苗POD 以及蓮藕POD 的氧化能力要大得多。不同化合物對羊蹄葉片POD的活性有影響.其中，CuSO4對羊蹄葉片POD 活性有激活作用;ZnSO4、MgSO4、CaCl2、KCl 和NaCl 對POD 活性有抑制作用。

由于羊蹄葉POD 對H2O2非常敏感，可以防止H2O2對植物的損傷，并且它的活性受到多種無機鹽的抑制，所以可以用于植物的水培生根和幼苗生長。羊蹄葉中POD 能催化H2O2氧化一些多酚類物質(zhì)合成木質(zhì)素促進植物生長，同時羊蹄葉中POD 對H2O2的親和力遠遠大于對愈創(chuàng)木酚的親和力，說明這種酶可以用于在逆境中植物或者組織塊的生長來保護植物組織。本文研究羊蹄葉片POD 的分離純化和其酶學(xué)性質(zhì)，對理解羊蹄植物的在冬天能夠正常生長的習(xí)性具有重要的意義并進一步運用其酶學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 Yuan MD (原牡丹)，Su Y (蘇艷)，Hou ZX (侯智霞)，et al.Changing characteristics of auxin and the relative enzymes during the process of strawberry fruit development.J Beijing For Univ(北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2009，31:169-175.

2 Jiang XL (蔣選利)，Li ZQ (李振岐)，Kang ZS (康振生).The recent progress of research on peroxidase in plant disease resistance.J Southwest A＆F Univ，Nat Sci(西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，自科版)，2001，29:124-129.

3 Li JJ (李建軍)，Wang L (王琳)，Li XJ (李小娟)，et al.Effects of the Radish peroxidase on the growth in tomato seedling.J Henan Norm Univ，Nat Sci(河南師范大學(xué)學(xué)報，自科學(xué))，2006，34:132-135.

4 Zhang LH (張麗華)，Xue WH (薛萬華)，Bai PY (白培萬)，et al.Application of peroxidase in phenolic wastewater pollution control.J Shanxi Datong Univ，Nat Sci(山西大同大學(xué)學(xué)報)，2009，25(6):44-47.

5 Gong FC，Liu P，Lin YY，et al.An enzyme-catalyzed reaction system using puerarin as substrates for Horseradish peroxidase and its application in immunoassays.Acta Chim Sin，2012，70:859-863.

6 Institute of Botany of the Chinese Academy of Sciences (中國科學(xué)院植物研究所).Iconographia Cormophytorum Sinicorum Tomus I (中國高等植物圖鑒I).Beijing:Science Press，1972.571.

7 Flora of China Editorial Committee (中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會).Flora of China (中國植物志).Beijing:Science Press，1998，25:156.

8 Xiao LT (蕭浪濤)，Wang SG (王三根).Technique of Plant Physiology Experiments (植物生理學(xué)實驗技術(shù)).Beijing:China Agricultural Press，2005.103-104.

9 Chen JH (陳鈞輝)，Li J (李俊)，Zhang TP (張?zhí)?，et al.Biochemistry Experiments，the Fourth Edition(生物化學(xué)實驗，第四版).Beijing:Science Press，2008.18-21.

10 Xu ZY(徐芝勇)，Yan Q(嚴群)，Qiang Y(強毅)，et al.Purification and enzymology property investigation on soybean peroxidase.J Chin Cereals Oils Assoc(中國糧油學(xué)報)，2006，21(2):82-85.

11 Wang Q (王倩)，Liu W (劉偉)，Liu CM (劉成梅)，et al.Characterization and effect of dynamic high-pressure microfluidization on peroxidase from fuji apple.Food Machine(食品與機械)，2011，2:4-7.

12 He P (何平)，Shi WP(施偉平)，F(xiàn)u XL(傅雪琳)，et al.The purification of peroxidase from sugarcane seeding and its characteristic.J Shanghai Jiaotong Univ，Agric Sci(上海交通大學(xué)學(xué)報，農(nóng)科版)，2003，21(2):131-134.

13 Ding XY (丁薪源)，Cao JK (曹建康).Characteristics of peroxidase from fruit and vegetable research progress.Food Sci Tech(食品科技)，2012，37(10):62-66.

14 Que RQ(闕瑞琦)，Zhang LL(張麗麗)，Guo XL(郭小路)，et al.Isolation，purification and properties of peroxidase from lotus (Nelumbo nuciferaGaertnl)root.J Southwest Univ，Nat Sci(西南大學(xué)學(xué)報，自科版)，2007，29(12):63-67.

15 Ding XY (丁薪源)，Zhou NN (周娜娜)，Zhao YM (趙玉梅)，et al.Characteristics of peroxidase from Zizyphus jujuba Mil.Food Sci Tech(食品科技)，2012，4:31-34，39.

16 Zhu H (朱鴻)，Li XY (李想韻)，Deng Y (鄧玉)，et al.Isolation，purification and enzymological characterization of catalase from Aloe.Food Sci(食品科學(xué))，2010，31):206-210.