槲皮素鉍的合成及其生物活性研究

翟廣玉，渠文濤，馬海英，韓 冰，樊衛(wèi)華*

1鄭州大學(xué)護理學(xué)院;2 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450052

鉍是人和生物體非必需的微量元素。鉍及其化合物在醫(yī)藥上廣泛應(yīng)用，臨床上主要治療各種微生物感染，包括梅毒、腹瀉、胃炎和結(jié)腸炎等［1］?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)鉍及其化合物可以抑制癌細胞生長，具有抗癌活性，起輔助抗癌的作用［2］。

槲皮素(quercetin，圖1)屬于黃酮類，含有酚類結(jié)構(gòu)的天然化合物，廣泛存在于水果(蘋果、草莓)、蔬菜(洋蔥、蕃茄)、飲料(茶葉、咖啡、紅酒)中［3］，它顯示出多方面的生物活性，是天然的抗氧化劑，特別是具有清除體內(nèi)自由基的性能，保護細胞氧化造成的損傷，能夠調(diào)整細胞內(nèi)信號，促進細胞的存活［5］，還具有抗炎［4］、抗病毒［5］、降血壓［6］、預(yù)防心腦血管疾?。?］、防癌抗癌作用［8］。

槲皮素對金屬離子具有強烈的螯合作用，可生成穩(wěn)定的環(huán)狀配合物。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與不同金屬離子形成配合物，其生物活性得到了不同程度的改善。Ferrer EG 等［9］合成了槲皮素釩配合物，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素釩可以刺激I 型骨生長，對磷酸酯酶有抑制作用，可促進骨細胞的分裂、增殖，具有抗骨癌的作用。Zhou J 等［10］合成了槲皮素銅，研究表明槲皮素銅能夠插入DNA 的堿基對中，從而影響DNA分子的構(gòu)型，抑制了DNA 分子的進一步復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，最終達到抗癌效果。Tabassum S 等［11］合成了槲皮素-CuⅡ-SnⅣ2配合物，可改變DNA 單鏈和雙螺旋結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)，可以激活SOD 酶活性，清除活性氧，具有顯著的抗癌活性。近年來，對槲皮素金屬配合物的研究逐年增多，這對槲皮素的開發(fā)利用及尋找新藥開辟了新的途徑［12］。這提示經(jīng)常食用一些含有槲皮素的黃酮類的食物，如蘋果、洋蔥、茶葉、銀杏、蕎麥等，可清除體內(nèi)的自由基，使機體免受自由基的損傷，對降低人體內(nèi)重金屬離子的含量起著重要的作用。本文介紹了合成槲皮素鉍的方法，并對其結(jié)構(gòu)進行了表征，研究了清除自由基的能力。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of quercetin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素(自制)，氯化鉍(分析純)，其他試劑均為分析純。

FTS-3000 型紅外光譜儀(KBr 壓片);德國耐馳(Netzsch)STA 409 PC/PG 差熱分析儀;UV-240 型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);400 MHz 核磁共振儀(Bruker);RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 槲皮素鉍的制備

將文獻［13］方法適當改進，在三頸燒瓶中，取1 mmol(302 mg)槲皮素，加入25 mL 甲醇，攪拌使完全溶解，加入甲醇鈉調(diào)pH=8.5。加入預(yù)先溶于25 mL 甲醇中的1 mmol(315.34 mg)無水氯化鉍溶液。在可加熱的磁力攪拌器上加熱回流6 h。用硅膠G板監(jiān)控反應(yīng)進程，待反應(yīng)完成時停止回流。過濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，得棕黃色固體，用甲醇沖洗三次，真空干燥器中干燥，得深棕黃色固體。

槲皮素鉍為深棕黃色粉末，溶于甲醇、乙醇、DMSO，微溶于丙酮，乙酸乙酯，不溶于苯和甲苯。

1.3 清除自由基實驗

溶液的配制:1 ×10-4mol/L 的DPPH 溶液的配制:精密稱取10 mg DPPH，置于250 mL 容量瓶中，加入少量無水乙醇，待溶解后再用無水乙醇定容至刻度，混勻，避光，置于冰箱保存。供試液的配制:精密取各樣品適量，以乙醇為溶劑，分別配制100、80、60、40、20 mg/L 的待測溶液。精確吸取不同濃度的樣品溶液1 mL，分別與3 mL 1 ×10-4mol/L 的DPPH溶液混合，避光放置30 min，在517 nm 處測吸光度Ay。以相應(yīng)溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為As，相應(yīng)樣品溶液的吸光度為A0。DPPH 自由基清除活性按下式計算:

式中，Ay為1 mL 樣品溶液與3 mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值;As為1 mL 乙醇溶液與3 mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值;A0為1 mL 樣品溶液與3 mL 乙醇溶液混勻后的吸光度值;參考文獻［13］計算自由基半數(shù)清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜分析

槲皮素在258 nm 和360 nm 有兩個吸收峰，分別屬于n→π* (A 環(huán))電子躍遷和π→π* (B 環(huán))電子躍遷，分別對應(yīng)兩個生色團組成:258 nm 吸收帶由苯甲酰生色團產(chǎn)生，為帶Ⅱ;360 nm 吸收帶由肉桂酰生色團產(chǎn)生，為帶Ⅰ。

圖2 槲皮素的結(jié)構(gòu)及其紫外光譜特征Fig.2 Structure and UV-Visible absorption characteristics of quercetin

槲皮素鉍的UV 吸收帶Ⅱ由258 nm 紅移至265 nm，紅移7 nm;帶Ⅰ由360 nm 紅移至465 nm，紅移95 nm(圖2、3)。這是由于形成配合物后，共軛體系增大，能量降低，最大吸收向長波方向移動引起的。帶Ⅰ紅移遠遠大于帶Ⅱ，這說明Bi3+是在帶Ⅰ區(qū)域內(nèi)與槲皮素配位形成配合物的。

圖3 槲皮素和槲皮素鉍的紫外光譜重疊圖Fig.3 UV-Visble spectra of quercetin and quercetin-Bi complexes

2.2 紅外光譜分析

槲皮素分子主要官能團紅外吸收歸屬:υC=O1663.10 cm-1;苯環(huán)骨架振動頻率υC=C1610.89 cm-1，1449.49 cm-1;δC3-OH1382.03 cm-1;υC-O酚1319.41 cm-1;υ-OH3408.74 cm-1。

槲皮素鉍的紅外光譜顯示，羰基吸收峰υC=O1663.10 cm-1，紅移至1648.48 cm-1，這是因為羰基形成了配合物引起的。槲皮素的特征吸收峰υ-OH3408.74 cm-1吸收，在槲皮素鉍中是3420.34 cm-1幾乎沒有發(fā)生變化，這說明槲皮素的基本骨架沒有發(fā)生變化。

圖4 槲皮素(A)和槲皮素鉍(B)的紅外光譜Fig.4 IR spectrum of quercetin (A)and quercetin-Bi complexes (B)

槲皮素和槲皮素鉍的紅外圖譜特征吸收峰比較結(jié)果顯示:①槲皮素的υC=O1663.10 cm-1羰基振動頻率移至1648.48 cm-1，向紅移了14.62 cm-1，可見槲皮素的4-羰基參與了槲皮素鉍配合物的形成［13］。②槲皮素鉍配合物在613.52 cm-1出現(xiàn)了υM-O，說明有金屬配位鍵生成。③苯環(huán)骨架振動頻率υC=C1610.89 cm-1，和υC-O-C1262.46cm-1，分別移至1597.45 cm-1和1269.60 cm-1，說明在形成配合物后，苯環(huán)骨架的存在，只是向紅移動了約幾個—幾十個波數(shù)［13］。

2.3 槲皮素鉍的氫譜

1H NMR 譜是鑒定黃酮化合物的結(jié)構(gòu)類型、確定取代基的位置和進行結(jié)構(gòu)研究的有效方法。氫譜可以提供有關(guān)分子中不同種類氫原子的情況，如根據(jù)化學(xué)位移和偶合常數(shù)可以判斷有關(guān)氫原子的化學(xué)環(huán)境，每種不同環(huán)境下氫原子的數(shù)目以及每個氫原子相鄰的基團的結(jié)構(gòu)等。槲皮素和槲皮素鉍1HNMR 譜中每個氫原子的歸屬(400 MHz;DMSO-d6ppm)見表1。

表1 槲皮素和槲皮素鉍1H-NMR 譜Table 1 1H-NMR data for quercetin and quercetin-Bi complexes (ppm)

由上述氫譜數(shù)據(jù)可知，槲皮素鉍中的3＇-OH 上的氫消失，而其它4 個羥基(7-OH，5-OH，3-OH，4＇-OH)上的氫依然存在，這說明槲皮素的3＇位羥基與鉍離子結(jié)合。這與紫外光譜和紅外光譜數(shù)據(jù)是一致的［14］。

2.4 熱差分析

加熱可引起物質(zhì)的物理、化學(xué)變化，同時伴隨放熱和吸熱的產(chǎn)生，以及質(zhì)量的變化。通過熱重分析，可以了解配合物的穩(wěn)定性，及其結(jié)構(gòu)特征。在靜態(tài)空氣氣氛，升溫速度為10 ℃/min，差熱量程為100 μV，測定溫度范圍從室溫到784 ℃。

對槲皮素鉍的熱分析顯示出裂解分解過程［15］。配合物的DSC 曲線上呈現(xiàn)出吸熱和放熱峰與熱重分析一致。

圖5 示差熱重分析圖Fig.5 Thermogravimetric analysis of quercetin-Bi complexes

在151 ℃附近的放熱峰對應(yīng)于槲皮素鉍的第一步分解，主要是失去結(jié)晶水，4 個H2O，對應(yīng)質(zhì)量損失為13.37%。在397 ℃附近的放熱峰對應(yīng)于殘余有機物的氧化分解，對應(yīng)質(zhì)量損失為48.14%。在749 ℃附近，失去CHO，對應(yīng)質(zhì)量損失為4.90%。最后剩余的殘渣是三氧化二鉍。

表1 槲皮素鉍分解與失重的最大溫度Table 1 The Tmax(℃)and weight loss values of the decomposition stages for the quercetin-Bi complexes

由上述槲皮素鉍的熱分解實驗，根據(jù)殘渣的重量，可以計算出氧化鉍中鉍的含量(實驗值):

槲皮素鉍中鉍的含量(理論值):

由上述計算結(jié)果可以看出，實驗值與理論值誤差很小。結(jié)合紫外光譜、紅外光譜、氫譜和熱分析圖譜可以寫出槲皮素鉍配合物的結(jié)構(gòu)為:

圖6 槲皮素鉍的結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structure of quercetin-Bi complexes

2.5 槲皮素鉍清除DPPH 自由基的作用

DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517 nm 處有最大吸收，當有自由基清除劑存在時，由于DPPH 自由基的單電子被配對，從而使得在517 nm 處的吸光度減小，因此該法常被用來評價樣品的抗氧化能力［12］。

圖7 槲皮素和槲皮素鉍對DPPH 自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of quercetin and quercetin-Bi complexes on on DPPH free radical

從圖7 可見，槲皮素和槲皮素鉍都隨著濃度的增大，對DPPH 自由基的清除率也增大，但是很明顯槲皮素與鉍離子形成配合物后，其對DPPH 自由基的清除能力略有降低。根據(jù)實驗結(jié)果，槲皮素鉍與槲皮素的EC50分別是8.17 mg/L 和14.07 mg/L，進一步說明槲皮素在與鉍配位后，其清除DPPH 自由基能力降低，這可能是形成配合物后，鄰二酚結(jié)構(gòu)的羥基與鉍離子配位，使其接受質(zhì)子的能力降低引起的。

3 結(jié)論

槲皮素與氯化鉍在堿性條件下，可生成槲皮素鉍配合物。通過紫外、紅外、核磁、熱分析等手段對槲皮素鉍進行了結(jié)構(gòu)表征。光譜數(shù)據(jù)闡明了配位的位點:槲皮素的3＇位羥基與鉍離子結(jié)合。通過DPPH 法測定了槲皮素鉍清除自由基的能力，通過實驗顯示，槲皮素鉍清除DPPH 自由基的能力弱于槲皮素。

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