雞血藤中黃酮類化合物與環(huán)氧合酶-2 對(duì)接研究

蔣延超，蔣世云，傅鳳鳴，黃 凱，康星欣，徐 丹

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，柳州 545006

大量臨床并發(fā)癥是由炎癥導(dǎo)致的，因此開發(fā)高效、副作用低的抗炎藥物對(duì)于人類健康十分重要。前列腺素是炎癥反應(yīng)中最主要的炎癥介質(zhì)之一，環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶。環(huán)氧合酶被證實(shí)存在兩種亞型［1］，即結(jié)構(gòu)型環(huán)氧合酶-1(COX-1)、誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶-2(COX-2)。由COX-1 催化合成的前列腺素具有保護(hù)胃腸道黏膜免受外界刺激，維持正常的腎功能和凝血功能等作用，而由COX-2 催化合成的各種前列腺素(PGE2、PGI2)則具有致炎效應(yīng)［2］。

目前應(yīng)用的非甾體抗炎藥存在嚴(yán)重的胃腸道、心血管等副作用，因此開發(fā)副作用低的新型抗炎藥物勢(shì)在必行。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，發(fā)達(dá)國家超過80%的人們更相信從植物中提取的藥物。最近，國內(nèi)外十分重視從傳統(tǒng)植物藥中研究開發(fā)新型選擇性抑制COX-2 的抗炎藥物，以降低非甾體抗炎藥對(duì)胃和腎臟等的副作用。雞血藤為豆科植物密花豆屬密花豆(Spatholobus suberectus Dunn)的干燥藤莖，已被證明具有抗炎作用［3，4］。該草藥化學(xué)成分穩(wěn)定，提取工藝簡單，臨床應(yīng)用廣泛，是一個(gè)很有醫(yī)用價(jià)值和開發(fā)前景的中藥。雞血藤中大量黃酮類化合物已被鑒定出來。本研究旨在篩選雞血藤中對(duì)COX-2 有選擇性抑制活性的黃酮類化合物，并從分子角度出發(fā)深入研究黃酮類化合物與COX-2 的作用機(jī)制。

本研究應(yīng)用大分子對(duì)接軟件包Autodock 4.2 對(duì)雞血藤中黃酮類化合物與COX 進(jìn)行模擬對(duì)接，篩選雞血藤中具有COX-2 選擇性抑制活性的黃酮類化合物，從分子水平研究黃酮類化合物對(duì)COX-2 的抑制機(jī)理，為闡明黃酮類化合物的抗炎機(jī)制提供依據(jù)。

圖1 7 種抗COX-2 黃酮類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of seven flavonoids inhibitors with COX-2

圖2 7 種抗COX-1 多環(huán)類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structure of seven polycyclics inhibitors with COX-1

圖3 雞血藤中黃酮類搜集物的二維結(jié)構(gòu)式Fig.3 The structure of flavonoids of S.suberectus

1 材料與方法

對(duì)接研究使用Autodock 4.2 軟件，數(shù)據(jù)處理使用origin 8.0 軟件。

1.1 配體的構(gòu)建

本研究考察了兩種類型的配體，陽性抑制劑及雞血藤中的黃酮類化合物。陽性抑制劑根據(jù)對(duì)接的酶分為與COX-2 對(duì)接的7 種黃酮類抑制劑和與COX-1 對(duì)接的7 種多環(huán)抑制劑。7 種黃酮類抑制劑命名為1-7，其相應(yīng)的半抑制濃度分別為28.6、2.5、0.365、0.269、1.26、0.517 和25.5 μmol/L［5-8］。7 種多環(huán)類抑制劑命名為8-14，其相應(yīng)的半抑制濃度分別為0.015、0.38、0.48、1.33、12.8、18.8、100 μmol/L［9-11］。7 種黃酮類抑制劑相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1，7種多環(huán)抑制劑相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2，雞血藤中黃酮類搜集物的二維結(jié)構(gòu)如圖3［12-14］?；衔锏亩S結(jié)構(gòu)通過化學(xué)軟件Chemoffice 構(gòu)建并利用MM2 立場將分子的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最優(yōu)化。

1.2 配體結(jié)構(gòu)的預(yù)處理

在進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)之前，合并配體中的非極性氫原子，并加上Gasteiger 電荷。配體中可旋轉(zhuǎn)鍵通過Autodock-Tools 1.5.4 軟件中的Ligand 子程序包自動(dòng)檢測，且在構(gòu)象搜索過程中這些可旋轉(zhuǎn)鍵全部設(shè)置為活性的旋轉(zhuǎn)鍵。

1.3 受體結(jié)構(gòu)的預(yù)處理

對(duì)接所用的COX-1 和COX-2 的三維結(jié)構(gòu)從美國布魯克海文(Brookhaven)國家實(shí)驗(yàn)室運(yùn)作的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中下載獲得，PDB 代碼分別為1CQE 和6COX。在進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)用Autodock Tools 1.5.4 軟件給蛋白加氫并計(jì)算Gasteiger 電荷，合并非極性氫原子，確定原子類型，糾正COX 中氨基酸殘基上非整數(shù)的電荷。

1.4 對(duì)接參數(shù)的設(shè)置

本研究對(duì)接過程采用半柔性對(duì)接，即配體設(shè)置為柔性，受體設(shè)置為剛性。在格點(diǎn)盒子中，x 維、y 維和z 維格點(diǎn)的數(shù)目依次設(shè)為80、80、80。該格點(diǎn)盒子的空間大小設(shè)為0.375 ?。該格點(diǎn)盒子的中心設(shè)為27.678、29.495、40.113。配體構(gòu)象搜索過程使用拉馬克遺傳算法(Lamarckian Genetic Algotithm，LGA)，拉馬克遺傳算法對(duì)接的輪數(shù)設(shè)為100，能量評(píng)估的最大數(shù)目設(shè)為250 萬。其他沒有提及的參數(shù)都使用該軟件的默認(rèn)參數(shù)。對(duì)于與COX-2 結(jié)合自由能較低的雞血藤中黃酮類小分子，進(jìn)一步將其與COX-1 對(duì)接，對(duì)接過程參數(shù)設(shè)置與COX-2 相同。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 復(fù)合物SC-558-COX-2 分子結(jié)構(gòu)的晶體重現(xiàn)

為考察Autodock 4.2 參數(shù)設(shè)置是否合理，將抑制劑SC-558 與COX-2 按上述參數(shù)設(shè)置進(jìn)行分子對(duì)接，然后與晶體結(jié)構(gòu)(ID:6COX)相比較。如圖4 所示，分子對(duì)接結(jié)果與復(fù)合物SC-558-COX-2 晶體結(jié)構(gòu)非常一致。兩個(gè)結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RMSD)為0.68，表明Autodock 4.2 可以很好的重現(xiàn)原晶體結(jié)構(gòu)，完全適用于該體系的研究。

圖4 復(fù)合物SC-558-COX-2 分子結(jié)構(gòu)的晶體重現(xiàn)Fig.4 Repeat the crystal structure of complex SC-558-COX-2

2.2 Autodock 4.2 軟件對(duì)接的結(jié)果

在用Origin 8.0 軟件對(duì)用Autodock 4.2 軟件計(jì)算的結(jié)合自由能與實(shí)驗(yàn)的抑制活性作圖之前，抑制劑半抑制濃度單位μmol/L 被轉(zhuǎn)化為mol/L，并取負(fù)對(duì)數(shù)，將其化為pIC50。由Autodock 4.2 軟件預(yù)測的黃酮類抑制劑與COX-2 之間的結(jié)合自由能、多環(huán)類抑制劑與COX-1 之間的結(jié)合自由能以及雞血藤中黃酮類化合物與COX 之間的結(jié)合自由能見表1、表2、表3。線性回歸分析得到預(yù)測的結(jié)合自由能(△G)與COX-2、COX-1 的陽性抑制劑抑制活性之間的關(guān)系為:△G=2.21404-2.42926 ×(pIC50)，R2=0.96997 (圖5a);△G=-5.64046-0.48574 ×(pIC50)，R2=0.84171(圖5b)。由線性回歸分析可知，用Autodock 4.2 軟件預(yù)測的結(jié)合自由能與實(shí)驗(yàn)獲得的半抑制濃度的負(fù)對(duì)數(shù)之間存在良好的相關(guān)性，因?yàn)闆Q定系數(shù)R2高達(dá)0.96997 和0.84171，P 值分別為0.00003 和0.00226，這些數(shù)值都是可以接受的值，進(jìn)而也可以說明通過Autodock 4.2 軟件預(yù)測的半抑制濃度接近于實(shí)驗(yàn)獲得的半抑制濃度。

表1 黃酮類抑制劑與COX-2 預(yù)測的結(jié)合自由能及其pIC50Table 1 The binding energy and pIC50 of flavonoids inhibitors with COX-2

表2 多環(huán)類抑制劑與COX-1 預(yù)測的結(jié)合自由能及其pIC50Table 2 The binding energy and pIC50 of polycyclics inhibitors with COX-1

圖5 黃酮類抑制劑與COX-2(a)、多環(huán)類抑制劑與COX-1(b)預(yù)測的結(jié)合自能與抑制活性之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between the binding energy calculated and the pIC50of positive inhibitors

表3 雞血藤中黃酮類化合物與COX 的結(jié)合能及選擇性Table 3 The binding energy and selectivity of flavonoids of S.suberectus with COX

2.3 篩選結(jié)果

通過與COX-1 和COX-2 的對(duì)接研究(表3)可得，3＇，4＇，7-三羥基黃酮(3＇，4＇，7-Trihydroxyflavone)、圣草酚(Eriodictyol)、兒茶素(Catechin)、紫鉚素(Butin)、沒食子兒茶素(Gallocatechin)、表兒茶素(Epicatechin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)具有較強(qiáng)的抗COX-2 活性，其中，沒食子兒茶素(Gallocatechin)、兒茶素(Catechin)、表兒茶素(Epicatechin)、3＇，4＇，7-三羥基黃酮(3＇，4＇，7-Trihydroxyflavone)對(duì)COX-2 有較好的選擇性抑制活性。

2.4 分子結(jié)合模式

COX-2 的活性位點(diǎn)由三部分組成:一是由Tyr385、Trp387、Phe381、Ser530、Met522、Leu384 等殘基組成的體積較大的疏水口袋，二是由Arg120、Glu524、Tyr355 等親水殘基組成的底物入口，三是由His90、Arg513、Val523、Gln192 等殘基組成的體積較小的側(cè)面口袋。對(duì)接研究表明，黃酮類抑制劑與COX-2 有多種結(jié)合模式。

7 種黃酮類抑制劑中活性最強(qiáng)和最弱的化合物4 和1 與COX-2 受體活性部位對(duì)接后的分子結(jié)合模型見圖6，篩選得到的雞血藤中具有較強(qiáng)抗COX-2活性的各類黃酮類化合物與COX-2 的結(jié)合模式見圖7，結(jié)合模式中配體的構(gòu)象是基于與COX-2 對(duì)接時(shí)容量最大的簇中結(jié)合自由能最低時(shí)的構(gòu)象。

圖6 抑制劑4(a)、1(b)與受體COX-2 活性位點(diǎn)的相互作用模式Fig.6 The binding mode of inhibitor 4 (a)and 1 (b)against COX-2

由圖6 可知，抑制劑4 的B 環(huán)占據(jù)了COX-2 的側(cè)面口袋，D 環(huán)朝向疏水口袋，與Ala516、Val349、Trp387、Leu359、Leu352、Ala527、Tyr355、Phe518、Val523 等疏水殘基發(fā)生疏水相互作用。抑制劑4與COX-2 之間沒有氫鍵形成，這可能意味著抑制劑4 對(duì)COX-2 的抑制活性不是由氫鍵作用產(chǎn)生的，而是通過與酶活中心處殘基的范德華力及溶劑化作用等產(chǎn)生的。抑制劑1 的A 環(huán)占據(jù)COX-2 的側(cè)面口袋，B 環(huán)臨近疏水口袋，其3＇、5 和7 位羥基分別與Ser530、Ser353 和Gln192 形成了一個(gè)長2.178、2.023、1.88 ? 的氫鍵，并與Phe518、Ala516、Tyr355、Val523、Leu352、Tyr385、Val349 等疏水殘基存在疏水相互作用。

本課題研究的雞血藤中15 種黃酮類化合物由黃酮化合物、異黃酮、黃烷酮和黃烷-3-醇組成。從圖7 可以看出，各類化合物與COX-2 的結(jié)合模式基本一致。黃酮化合物3＇，4＇，7-Trihydroxyflavone 的A環(huán)位于疏水口袋中，B 環(huán)占據(jù)側(cè)面口袋，其3＇、4＇位羥基分別和His90、Ser353 形成了一個(gè)長1.991、2.191? 的 氫 鍵，并 與 Trp387、Tyr355、Phe518、Val523、Ala527、Met522、Leu352 等殘基具有疏水相互作用。異黃酮化合物Calycosin 的B 環(huán)占據(jù)側(cè)面口袋，A 環(huán)朝向疏水口袋，其3＇、7 位羥基分別和Gln192 和Gly526 形成了一個(gè)長1.984、2.073? 的氫鍵，并與Tyr385、Phe518、Val523、Ala516、Met522、Leu352、Gly526 等殘基具有疏水相互作用。黃烷酮化合物的A 環(huán)占據(jù)疏水口袋，B 環(huán)朝向側(cè)面口袋。其中，Butin 的4＇、7 位羥基分別和His90、Met522 形成了一個(gè)長1.991、2.148? 的氫鍵。黃烷-3 醇化合物的A 環(huán)朝向疏水口袋，B 環(huán)占據(jù)側(cè)面口袋。其中，Gallocatechin 的3＇、4＇、5、7 位羥基分別和Gln192、His90、Ser530、Met522 形成了一個(gè)2.083、1.764、2.231、2.132 ? 的 氫 鍵，并 與Tyr385、Phe518、Val349、Ala516、Met522、Leu352、Gly526 等疏水殘基發(fā)生疏水相互作用。

圖7 配體3＇，4＇，7-三羥基黃酮(a)、毛蕊異黃酮(b)、紫鉚素(c)和沒食子兒茶素(d)與受體COX-2 活性位點(diǎn)的相互作用模式Fig.7 The binding mode of 3＇，4＇，7-trihydroxyflavone (a)，calycosin (b)，butin (c)and gallocatechin catechin (d)against COX-2

3 討論

通過從圖6 中比較黃酮、異黃酮、黃烷酮和黃烷-3-醇與COX-2 的分子理論結(jié)合模式可以看出:位于A、B 環(huán)上的取代基羥基，一類強(qiáng)極性基團(tuán)，能夠與受體分子COX-2 活性部位中的極性氨基酸殘基之間形成分子間的氫鍵而發(fā)生相互作用。形成的分子之間的氫鍵在決定配體化合物在受體COX-2 活性部位中的取向時(shí)起到很大的作用。配體化合物中疏水性主體A、B 環(huán)能夠與受體COX-2 活性部位中的疏水性氨基酸殘基如Trp387、Tyr355、Phe518、Val523、Ala527、Met522、Leu352 等通過疏水作用力而發(fā)生相互作用。因此，位于兩端的分子之間的氫鍵有助于穩(wěn)定疏水性相互作用力。

篩選得到的7 種對(duì)COX-2 有較強(qiáng)抑制活性的黃酮類化合物中黃酮3＇，4＇，7-Trihydroxyflavone、黃烷酮Eriodictyol 和Butin 以及黃烷-3-醇Catechin 和Epicatechin 的結(jié)構(gòu)中均包含一個(gè)鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，這說明鄰苯二酚結(jié)構(gòu)對(duì)黃酮類化合物的抗COX-2 活性可能十分重要。對(duì)于黃烷酮化合物來說，Butin 和Eriodictyol 與COX-2 的結(jié)合自由能要比其他配體小分子與COX-2 的結(jié)合自由能大得多，且Butin 與COX-2 的結(jié)合自由能大于Eriodictyol 與COX-2 的結(jié)合自由能，這有可能意味著A 環(huán)上的5、6 位的羥基和C 環(huán)的3 位的羥基能夠降低配體小分子對(duì)COX-2的抑制活性，且降低對(duì)COX-2 的抑制活性的能力依次為3 位羥基＞6 位羥基＞5 位羥基。對(duì)于黃酮化合物來說，Butin 與COX-2 的結(jié)合自由能要比3＇，4＇，7-Trihydroxyflavone 與COX-2 的結(jié)合自由能大得多，這可能意味著C 環(huán)的碳碳雙鍵不利于抗炎。對(duì)于黃烷-3-醇化合物來說，與2S 構(gòu)型的化合物相比，2R構(gòu)型的化合物似乎有利于配體與5-脂氧合酶的結(jié)合，即2R 構(gòu)型的化合物對(duì)5-脂氧合酶的抑制活性要比2S 構(gòu)型的化合物強(qiáng)。沒食子兒茶素與COX-2的結(jié)合自由能要比兒茶素和表兒茶素與COX-2 的結(jié)合自由能大得多，這有可能意味著B 環(huán)上的3＇、5＇羥基能夠增強(qiáng)配體小分子與COX-2 親和能力。這些結(jié)果提供了黃酮類化合物與COX-2 作用的基本原理，可能對(duì)新型COX-2 抑制劑的合理設(shè)計(jì)有所幫助。此外，本課題組曾篩選過雞血藤中黃酮類化合物抗5-脂氧合酶(5-LOX)活性，其中圣草酚(Eriodictyol)、兒茶素(Catechin)、紫鉚素(Butin)具有較強(qiáng)的抗5-LOX 活性。因此，圣草酚(Eriodictyol)、兒茶素(Catechin)、紫鉚素(Butin)具有較好的COX-2 和5-LOX 雙重抑制活性，兒茶素(Catechin)既具有較好的COX-2 和5-LOX 雙重抑制活性，又對(duì)COX-2具有較好的選擇性抑制活性。

4 結(jié)論

COX-1 和COX-2 均具有分叉結(jié)合口袋，側(cè)面口袋和疏水口袋。COX-1 的側(cè)面口袋結(jié)合位點(diǎn)中第523 號(hào)殘基由COX-2 中的Val 變成了體積較大的Ile，使得COX-1 的側(cè)面口袋小于COX-2，這一差異可能成為設(shè)計(jì)選擇性COX-2 的關(guān)鍵。通過將雞血藤中黃酮類化合物與COX-1 和COX-2 的對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，3＇，4＇，7-三羥基黃酮、圣草酚、兒茶素、紫鉚素、沒食子兒茶素、表兒茶素、毛蕊異黃酮具有較強(qiáng)的抗COX-2 活性。其中，沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、3＇，4＇，7-三羥基黃酮對(duì)COX-2 有較好的選擇性抑制活性，圣草酚、兒茶素、紫鉚素具有較好的COX-2 和5-LOX 雙重抑制活性。

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