章魚(yú)胺及其衍生物的抗氧化性研究

曲映紅，劉志東，陳舜勝

1上海海洋大學(xué)，上海 201306;2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090

關(guān)于章魚(yú)胺的生物活性，文獻(xiàn)報(bào)道多為肥胖癥的治療和II 型糖尿病防治方面的研究［1，2］。既往研究發(fā)現(xiàn)章魚(yú)胺的前體化合物酪胺具有較的抗氧化活性，且與其濃度呈正相關(guān)［3］。本研究以章魚(yú)胺為原料合成了十種章魚(yú)胺衍生物，測(cè)定了它們的抗氧化活性，并與酪胺相對(duì)比，以期對(duì)章魚(yú)胺的生物活性做進(jìn)一步研究。

許多研究證實(shí)，氧化與人類的許多疾病諸如老化、動(dòng)脈硬化、癌癥等的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，如自由基引發(fā)的氧化現(xiàn)象是機(jī)體衰老的主要原因。適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以抑制機(jī)體的自由基損傷，切斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抵御和防治相關(guān)疾病，延緩衰老，保持健康［4］。

在評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化活性時(shí)常采用測(cè)定其清除自由基能力的方法。同一種具有抗氧化活性的物質(zhì)以不同的自由基為底物時(shí)，得到的結(jié)果往往會(huì)有所差別。若要全面評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化性能，至少需要使用兩種方法，以驗(yàn)證其活性的高低。利用對(duì)DPPH 自由基的清除效果來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，是普遍采用的一種簡(jiǎn)便快速的方法。超氧陰離子自由基作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，是機(jī)體內(nèi)壽命最長(zhǎng)的自由基;羥基自由基是毒性最大、最活潑的自由基，反應(yīng)速率極快，是已知自由基中對(duì)人體危害最大的［5］。綜上所述，本研究通過(guò)考察對(duì)以上三種自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)章魚(yú)胺及其衍生物的抗氧化活性。

1 材料與儀器

1.1 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma 公司);2-甲基苯甲酸、4-甲基苯甲酸、3-羧基吡啶、苯甲酸、4-硝基苯甲酸、2，3-二甲氧基苯甲酸、正十一烷基酸、2-硝基-3-甲基苯甲酸、2，6-二甲氧基苯酸、3，5-二甲氧基苯甲酸(上述10 種物質(zhì)合稱取代酸);章魚(yú)胺，酪胺，N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺，乙酸乙酯，氯化鈉，無(wú)水硫酸鎂，石油醚，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鹽酸，雙氧水(H2O2)，水楊酸，F(xiàn)eSO4，乙醇，甲醇(分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)。

1.2 儀器

Bruker INOVA 400 NMR 核磁共振儀，Waters LCT Premier TM XE 高效液相色譜-Alliance 2695 Quattro micro 質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津UV-1601PC 分光光度計(jì)，攪拌器，抽濾機(jī)等。

2 方法

2.1 章魚(yú)胺衍生物的通用制備方法

將0.4 g(2.1 mmol)章魚(yú)胺，2.2 mmol 取代酸，0.32 g(2.1 mmol)HOBt·H2O，0.52 g(2.73 mmol)的EDC·HCl 投入8 mL 干燥的DMF 中，加入0.87 mL 三乙胺，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，薄層(TLC)掃描法監(jiān)測(cè)原料章魚(yú)胺反應(yīng)完全。加入10 mL 水和30 mL 乙酸乙酯，攪拌后分出乙酸乙酯層，水層再用乙酸乙酯萃取(30 mL × 2)，合并乙酸乙酯層，用飽和氯化鈉溶液洗滌(20 mL)，無(wú)水硫酸鎂干燥1 h，過(guò)濾，蒸干濾液，得到油狀物，加入5 mL 乙酸乙酯、5 mL 石油醚和0.2 mL 甲醇，室溫?cái)嚢? h，析出白色固體，抽濾，濾餅用少量乙酸乙酯洗滌后抽干，經(jīng)真空干燥得白色固體。

2.2 章魚(yú)胺、酪胺及章魚(yú)胺衍生物的抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定［6，7］

分別配制酪胺、章魚(yú)胺及章魚(yú)胺衍生物的5 mmol/L 甲醇溶液，同時(shí)配制濃度為0.5 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液。將4 mL 樣品溶液和1 mL DPPH溶液加入具塞試管中，搖勻，37 ℃避光放置30 min，在517 nm 測(cè)定其吸光度A1;將4 mL 樣品溶液和1 mL 甲醇按上法操作測(cè)定其吸光度A2;將4 mL 甲醇和1 mL DPPH 溶液按上法操作測(cè)定其吸光度A0。樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率K(%)根據(jù)下列公式計(jì)算:

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定［8］

清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境中發(fā)生氧化分解產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷在體系中積累，從而使反應(yīng)液在325 nm 處的吸光度發(fā)生變化。取50 mmol/L 的Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液4.6 mL 于試管中，25 ℃水浴中保溫15 min，加入樣品溶液1 mL，10 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻于25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)4 min，立即加入8 mol/L 的鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)，以Tris-HCl 緩沖液調(diào)零點(diǎn)，325 nm 下測(cè)其吸光值，即A1?？瞻讓?duì)照組(A0)用甲醇1 mL 代替樣品溶液，樣品對(duì)照組(A2)用甲醇0.4 mL 代替鄰苯三酚溶液。

清除率計(jì)算公式:

2.2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定［9］

清除羥基自由基活性的測(cè)定利用H2O2與Fe2+混合反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉羥基自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收。反應(yīng)體系中依次加入樣品溶液4 mL、9 mmol/L 的FeSO41 mL、9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入1 mL 8.8 mmol/L 的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴中保溫反應(yīng)30 min，測(cè)定510 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A1)。將體系中的樣品溶液改為加入4 mL 甲醇，其他試劑不變，測(cè)得空白對(duì)照吸光度(A0);當(dāng)向體系中加入1 mL 甲醇代替1 mL H2O2時(shí)，測(cè)得樣品對(duì)照吸光度(A2)。

清除率計(jì)算公式:

3 結(jié)果與分析

3.1 章魚(yú)胺衍生物的制備

共制備得到10 種章魚(yú)胺衍生物，如表1 所示。

表1 章魚(yú)胺衍生物Table 1 Octopamine derivatives

3.2 抗氧化活性分析

3.2.1 DPPH 自由基清除能力

章魚(yú)胺、酪胺及十種章魚(yú)胺衍生物的DPPH 清除率如圖1 所示?？梢钥闯?，這些物質(zhì)清除DPPH自由基的能力差別較大，經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，章魚(yú)胺、OA07、OA08 的DPPH 自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA02、OA04、OA05 的DPPH 自由基清除能力明顯低于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA01、OA03、OA06、OA09、OA10 與酪胺的DPPH 自由基清除能力無(wú)顯著性差異。

3.2.2 超氧陰離子自由基清除能力

圖1 章魚(yú)胺、酪胺及章魚(yú)胺衍生物的DPPH 自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against DPPH free radicals

章魚(yú)胺、酪胺及十種章魚(yú)胺衍生物的超氧陰離子自由基清除率如圖2 所示?？梢钥闯觯@些物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力差別較大，經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，章魚(yú)胺、OA05、OA07、OA08 的超氧陰離子自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA01、OA02、OA03、OA04、OA06、OA09、OA10 的超氧陰離子自由基清除能力明顯低于酪胺，且差異顯著(P＜0.01)。

圖2 章魚(yú)胺、酪胺及章魚(yú)胺衍生物的超氧陰離子自由基清除率Fig.2 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against superoxide anion radicals

圖3 章魚(yú)胺、酪胺及章魚(yú)胺衍生物的羥基自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against hydroxyl free radicals

3.2.3 羥基自由基清除能力

章魚(yú)胺、酪胺及十種章魚(yú)胺衍生物的羥基自由基清除率如圖3 所示?？梢钥闯?，這些物質(zhì)清除羥基自由基的能力差別較大，經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，章魚(yú)胺、OA01、OA02、OA03、OA04、OA06、OA07、OA08、OA09、OA10 的羥基自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA05 與酪胺的羥基自由基清除能力無(wú)顯著差異。

4 結(jié)論

本研究合成了章魚(yú)胺的10 種衍生物，比較了章魚(yú)胺、酪胺及10 種章魚(yú)胺衍生物的抗氧化活性。結(jié)果表明，章魚(yú)胺及其兩種衍生物OA07、OA08 對(duì)于DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力均高于章魚(yú)胺的前體化合物酪胺，且有顯著性差異(P＜0.01)。另一章魚(yú)胺衍生物OA05 具有很高的超氧陰離子自由基清除能力，但它對(duì)DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力較弱。前人研究中用β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法測(cè)定了酪胺清除過(guò)氧化自由基的能力，指出酪胺具有顯著抗氧化作用，且與其濃度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，酪胺雖然對(duì)DPPH 自由基和超氧陰離子自由基有一定的清除能力，但其清除羥基自由基的能力很弱。

以往研究中較多地提及章魚(yú)胺在減肥和治療Ⅱ型糖尿病方面的利用價(jià)值，本文中關(guān)于章魚(yú)胺及其衍生物抗氧化活性的研究將為進(jìn)一步探索章魚(yú)胺的生物活性提供一定的理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

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