竹根黃酮類成分對小鼠抗心肌缺血損傷的保護作用

陳力 徐彭

（1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，四川 成都610500；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌330004）

竹子是禾本科竹亞科多年生常綠植物，目前對竹類資源的開發(fā)多限于對竹葉的利用。學者們通過多種方法分離純化，測定出了竹葉的多種化學成分。其中竹葉中的黃酮類成分也被許多學者廣泛報道。有實驗［1］表明，竹葉黃酮類具有明顯的抗氧化、降血脂、耐缺氧、抗血栓及多項改善心腦血管功能的作用。為此，在進行“竹根的化學及其抗過敏活性物質的研究”預試研究的同時，本文結合國內外文獻報道和大量預實驗的基礎上，觀察竹根黃酮類成分對小鼠抗心肌缺血損傷的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑 青皮竹竹根采自江西中醫(yī)學院灣里校區(qū)周圍，經(jīng)江西中醫(yī)學院中藥鑒定教研室鑒定為禾本科箣竹屬植物青皮竹的干燥根。使用前將其切斷后用粉碎機粉碎，烘干后備用；竹根黃酮類成分1（1號樣品）、竹根黃酮類成分2（2號樣品），江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室制備；垂體后葉素注射液：南京新百藥有限公司，國藥準字H32026638，1mL，6U；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（100t）：南京建成生物工程研究所，批號20080919；丙二醛（MDA）試劑盒（100t）：南京建成生物工程研究所，批號20080919；香丹注射液（陽性藥物組）：四川三精升和制藥有限公司，國藥準字Z51021609，產(chǎn)品批號071210，規(guī)格10mL×5支。

1.2 儀器 千分之一電子天平，METTER－TOLEDO，型號PL203；萬分之一電子天平，Sartorius，型號BS 124S；低溫離心機：常州國華電器有限公司，型號80－2；電動玻璃組織勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司，型號DY89－1；pH計：上海三信儀表廠；隔水式電器恒溫培養(yǎng)箱：浙江紹興柯橋醫(yī)療器械廠，代號 HY35－35×40，編號79－102。

1.3 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，雌雄兼有，體質量18～22g，江西中醫(yī)學院實驗動物中心提供（合格證號：SCXK贛2005－0001）。恒溫，恒濕，實驗期間自由飲水，飼常規(guī)固體飼料。

1.4 方法 （1）對小鼠常壓耐缺氧的保護實驗：昆明小鼠60只，體質量18～22g，雌雄各半，按照隨機數(shù)字表分為6組，每組10只。分別為：1號樣品低劑量組（生藥6.94g／kg，下同）、1號樣品高劑量組（生藥13.88g／kg，下同）、2號樣品低劑量組（生藥12.05g／kg）、2 號 樣 品 高 劑 量 組 （生 藥24.10g／kg）、陽 性 對 照 組 （香 丹 注 射 液，15.60g／kg，下同）、NS空白對照組（20mL／kg）。各組按相應劑量連續(xù)給藥6d，末次給藥1h后，將各組動物置入200mL的密封廣口瓶中（瓶底鋪放20g鈉石灰以吸收水分和二氧化碳），觀察小鼠存活時間（以小鼠最后一次喘息抽搐的時間為止；所有數(shù)據(jù)最后都折算為以s為單位進行統(tǒng)計分析）［2］。（2）對夾閉氣管小鼠死亡的保護實驗：昆明種小鼠60只，體質量20～22g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表分為6組，分組方法與給藥劑量同（1）。各組按相應劑量連續(xù)給藥6d，末次給藥20min后，用水合氯醛腹腔注射麻醉（763.70mg／kg），暴露氣管并用動脈夾夾閉氣管，立即觀察并記錄喘息時間（以小鼠最后一次喘息抽搐的時間為止；所有數(shù)據(jù)最后都折算為以s為單位進行統(tǒng)計分析）［3］。（3）對小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響實驗：昆明種小鼠70只，體質量18～22g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表分為7組，每組10只。分別為：1號樣品低劑量組（生藥6.94g／kg）、1號樣品高劑量組（生藥13.88g／kg）、2號樣品低劑量組（生藥12.05g／kg）、2號樣品高劑 量 組 （生 藥 24.10g／kg）、陽 性 對 照 組（15.60g／kg）、NS空白對照組（20mL／kg）、NS模型對照組（20mL／kg）。各組按相應劑量連續(xù)給藥6d，末次給藥1h后，NS模型組和各受試組、陽性組均腹腔注射垂體后葉素（PIT），劑量為30U／kg；NS對照組腹腔注射等容積的NS溶液。注射PIT 15min后將動物處死立即摘取心臟，在冰冷（4℃）磷酸緩沖液（0.05mol／L pH 7.8含0.1mmol／L EDTA）中洗去血液，濾紙拭干，稱重；取心臟用眼科剪盡快剪碎，倒入玻璃勻漿管中，加入9倍于心臟重量的冰冷勻漿介質，將玻璃勻漿管插入盛有冰水混合物的容器中勻漿；將制備好的勻漿移入2mL離心管，用低溫離心機以2 000 r／min，4℃條件下離心10min，棄去沉淀；取上清液用低溫高速離心機以10 000 r／min，4 ℃條件下離心 15min，棄去上清液，沉淀物即為線粒體。將分離的線粒體用20倍的冰冷勻漿介質制備成混懸液，在0～4℃儲存，測定SOD 與 MDA 含量［4］。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗均采用單因素方差分析，結果以（±s）表示。

2 結 果

2.1 對小鼠常壓耐缺氧的保護實驗結果 對小鼠常壓耐缺氧的保護實驗結果見表1。

表1 小鼠常壓耐缺氧存活時間±s）

表1 小鼠常壓耐缺氧存活時間±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 動物數(shù) 存活時間／s 10 14.50±0.81 1號樣品低劑量組 10 16.05±2.29 1號樣品高劑量組 10 16.50±2.20＊2號樣品低劑量組 10 15.80±1.66 2號樣品高劑量組 10 17.05±2.29＊＊陽性對照組 10 17.70±2.33 NS空白對照組＊＊

2.2 對夾閉氣管小鼠死亡的保護實驗結果 對夾閉氣管小鼠死亡的保護實驗結果見表2。

表2 夾閉氣管小鼠喘息時間 （±s）

表2 夾閉氣管小鼠喘息時間 （±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.01。

組 別 動物數(shù) 喘息時間／s 10 78.00±7.86 1號樣品低劑量組 10 90.40±4.13＊1號樣品高劑量組 10 96.02±6.21＊2號樣品低劑量組 10 92.80±4.81＊2號樣品高劑量組 10 99.31±11.75＊陽性對照組 10 103.06±9.39 NS空白對照組＊

2.3 對小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響實驗結果 對小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響實驗結果見表3。

表3 小鼠心肌線粒體膜SOD、MDA含量比較（ˉx±s）

3 討 論

由于心肌在缺血時血流量減少，不能獲得足夠的氧氣，會導致其代謝過程紊亂，尤其是能量物質的生成劇減，正常心功能難以維持；因此，心肌缺血的最根本防治措施是改善血供，降低氧耗，通過清除或對抗有害物質對心肌的不良影響以保護心肌。

目前，心肌缺血的傳統(tǒng)藥物治療方案主要是以活血化瘀、理氣通脈的香丹注射液、復方丹參滴丸、地奧心血康和脈絡寧等復方制劑為主。我們選用經(jīng)現(xiàn)代研究證實的具有降低全血黏度和紅細胞壓積，降低由葡聚糖和膠原－腎上腺素引起的血小板聚集、提高心肌組織中SOD活力，降低MDA含量，提高Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶的活性、對急性心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護作用的香丹注射液為陽性藥物來復制相關的動物模型［5］。

從我們首先進行的小鼠常壓耐缺氧的保護實驗與對夾閉氣管小鼠死亡的保護實驗結果來看：竹根黃酮類成分均可以延長小鼠常壓耐缺氧的存活時間（1號樣品高劑量組和2號樣品高劑量組）、也能夠明顯延長夾閉小鼠氣管的存活時間（1號樣品各劑量組和2號樣品各劑量組）。這從整體動物實驗的角度，證實了禾本科箣竹屬植物青皮竹的干燥根中的黃酮類成分［6］，可以通過降低心肌耗氧量或改善心臟能量供應，對模型小鼠缺血心肌起到一定的保護作用。

心肌缺血時，打破了正常情況下氧自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，加上此時自由基清除酶的活性降低，導致體內大量自由基堆積［7］。氧自由基還可以與生物膜上的脂類物質反應形成多種脂質過氧化物，引起膜的流動性和通透性發(fā)生改變，使細胞膜的結構和功能受損，加劇心肌損傷和功能障礙［8－9］。

在缺血小鼠心肌細胞線粒體活性檢測的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，在相對比較極端的情況下（在實驗檢測之前，我們給小鼠注射垂體后葉素，加重小鼠心肌缺血狀態(tài)），1號樣品高劑量組和2號樣品組動物的心肌線粒體中MDA值均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，說明竹根黃酮類成分可以對抗垂體后葉素所導致的心肌線粒體的細胞膜損傷。但是給藥各組的SOD值高低，并不表現(xiàn)出顯著差異，這與文獻［10］的結果相一致，與文獻［11］不一致。說明竹根黃酮類成分是否是通過提高SOD活性來降低MDA，防止氧自由基對心肌線粒體的破壞的途徑，還有待于進一步的研究。

［1］ 陳力，劉利艷.竹根提取物抗Ⅰ型變態(tài)反應的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（5）：1053－1055.

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［4］ 趙明奇.通心絡改善缺血心肌供血的NO機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9（6）：43－45.

［5］ 楊超燕.香丹注射液抗心肌缺血有效部位的篩選及作用機制的研究［D］.廣東藥學院，2007：9.

［6］ 吳艷紅，張銳.竹根化學成分的研究（I）［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2403－2404.

［7］ 王堯，范佳，剛曉坤，等.腦出血治療中甘露醇使用的臨床體會［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2010，10：946－947.

［8］ 付偉，劉婷，楊彩玉，等.天山花楸葉總黃酮對大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26（2）：251－254.

［9］ Valko M，Leibfritz D，Moncola J，et al.Free radicals and antioxidants innormal physiological functions and human disease［J］.Int J Biochem Cell Bio，2007，39（1）：44－52.

［10］ 蘭云，明海霞.參參康心膠囊對小鼠心肌缺血線粒體膜SOD、MDA的影響 ［J］.中國醫(yī)學雜志，2008，6（3）：4－6.

［11］ 錢立娜，楊玉梅.贊丹－3湯滴丸對大鼠心肌缺血的保護作用及其機制初探 ［J］.中成藥，2014，36（7）：1524－1526.