參芪扶正注射液對潰瘍性結(jié)腸炎患者大腸黏膜CX3CR1的影響*

趙昌東，張小節(jié)△，張 磊，羅紅波，陳 嫻，張 輝，張一峰

(蚌埠醫(yī)學院附屬連云港市第二人民醫(yī)院：1.消化內(nèi)科 2.病理科，江蘇連云港 222023)

論著·臨床研究

參芪扶正注射液對潰瘍性結(jié)腸炎患者大腸黏膜CX3CR1的影響*

趙昌東1，張小節(jié)1△，張 磊2，羅紅波1，陳 嫻1，張 輝1，張一峰1

(蚌埠醫(yī)學院附屬連云港市第二人民醫(yī)院：1.消化內(nèi)科 2.病理科，江蘇連云港 222023)

目的觀察參芪扶正注射液聯(lián)合柳氮磺吡啶(SASP)治療潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的臨床治療效果，并探討參芪扶正注射液對UC患者大腸黏膜CX3CR1的影響。方法選擇2012年1月至2014 年6月在該院就診的輕中度活動期UC患者50例，將其分為觀察組、對照組，另設健康組15例，觀察組予以參芪扶正注射液聯(lián)合SASP治療，對照組予以SASP治療，健康組為空白對照。觀察所有UC患者治療前和治療2周后的改良Mayo評分結(jié)果，并觀察健康組及觀察組、對照組患者治療前和治療后2周同一病變部位大腸黏膜CX3CR1的表達情況。結(jié)果UC患者治療前大腸黏膜CX3CR1總陽性率為88.37%，健康組大腸黏膜CX3CR1總陽性率為20.00%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.689，P<0.01)；治療后2周，觀察組大腸黏膜CX3CR1的表達和改良Mayo評分結(jié)果均明顯低于對照組(P<0.05)；觀察組臨床綜合療效明顯優(yōu)于對照組(Z=-2.085，P<0.05)。結(jié)論參芪扶正注射液聯(lián)合SASP治療UC療效明顯優(yōu)于單純口服SASP，參芪扶正注射液可能通過抑制大腸黏膜CX3CR1的表達而參與了UC的治療。

結(jié)腸炎，潰瘍性；腸黏膜；參芪扶正注射液；CX3CR1

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是消化系統(tǒng)常見病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，缺乏特效治療方法。參芪扶正注射液由黨參和黃芪組成，黨參具有抗?jié)?、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強機體免疫應答的作用[1-3]，黃芪具有保護腸黏膜相關免疫細胞、維持腸黏膜微循環(huán)正常功能、提高腸黏膜抗氧化能力、調(diào)節(jié)細胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌和表達的作用[4-5]。近年來，應用“參芪扶正注射液聯(lián)合柳氮磺吡啶(SASP)”治療UC取得了良好的效果，但其治療UC可能的藥物作用機制尚不明確。

近年來，新發(fā)現(xiàn)的不規(guī)則趨化因子(fractalkine,Fkn，CX3CL1)受體CX3CR1被越來越多的學者重視，現(xiàn)已證實T細胞、NK細胞、單核-巨噬細胞表面存在CX3CR1，CX3CR1具有介導白細胞趨化及黏附的功能[6-7]。有研究表明，CX3CR1可通過與腸腔中的細菌直接接觸，捕獲細菌抗原，引起一系列的腸道黏膜免疫反應從而參與了UC的發(fā)病[8-10]。

本研究擬應用參芪扶正注射液聯(lián)合SASP治療輕中度UC，觀察其臨床療效，并應用免疫組織化學法觀察參芪扶正注射液對UC患者大腸黏膜CX3CR1表達的影響，探討其治療UC的可能藥物作用機制，從而為潰瘍性結(jié)腸炎治療提供新的思路和手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014 年6月在本院消化內(nèi)科就診的門診及住院輕中度UC(活動期)患者50例，其中男23例，女28例，年齡22～63歲，平均(35.180±9.256)歲，將其分為觀察組25例、對照組25例。另設健康組15例。3組在年齡、性別、職業(yè)、婚姻狀況、教育程度等構(gòu)成比上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，觀察組與對照組臨床嚴重程度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均進行臨床流行病學調(diào)查登記，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，根據(jù)個人意愿簽署知情同意書。

1.2 診斷與入組標準

1.2.1 UC的診斷及嚴重程度的分級標準 符合2007年濟南炎癥性腸病診斷治療規(guī)范共識意見的標準[11]，確診為活動期輕、中度UC患者。

1.2.2 臨床病例排除標準 (1)所有病例均排除感染性結(jié)腸炎、克羅恩病、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、大腸癌等疾??；(2)重度患者；(3)年齡在18歲以下或70歲以上，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)者；(4)合并精神病，心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)級等疾??；(5)治療依從性差者；(6)未按研究要求隨診者；(7)治療過程中發(fā)生嚴重不良事件者。

1.3 主要試劑 參芪扶正注射液(麗珠集團利民制藥廠)、兔抗人CX3CR1多克隆抗體(北京欣興唐生物科技有限公司)，其余試劑由本院病理科提供。

1.4 研究方法

1.4.1 給藥方法 觀察組應用“參芪扶正注射液250 mL靜脈滴注1次/天+SASP 1.0 g口服4次/天”治療，對照組應用“SASP 1.0 g口服4次/天”治療，觀察組和對照組均2周1個療程。

1.4.2 觀察指標 (1)臨床觀察指標：觀察所有患者治療前和治療后2周的排便次數(shù)、大便帶血情況、內(nèi)鏡下黏膜表現(xiàn)、改良Mayo評分[12]。(2)實驗室觀察指標：觀察對照組及所有UC患者治療前和治療后2周同一病變部位大腸黏膜CX3CR1的表達情況。

采用免疫組織化學SP染色法檢測大腸黏膜CX3CR1的表達，具體步驟如下：石蠟包埋，切片脫蠟至水，PBS洗3次；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波抗原修復，PBS洗3次；3%H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加入封閉用的正常羊血清工作液，室溫孵育10～15 min，傾去，風干，勿洗；滴加1∶200稀釋的Ⅰ抗(兔抗人 CX3CR1多克隆抗體)，37 ℃孵育2 h，置入4 ℃冰箱過夜；PBS洗3次；滴加生物素標記的Ⅱ抗(羊抗兔)37 ℃孵育60 min；PBS洗3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育10～15 mim；DAB室溫顯色，蒸餾水清洗，蘇木素復染，切片脫水，二甲苯透明，封片及結(jié)果判定。

免疫組織化學結(jié)果判定：CX3CR1陽性反應為細胞膜呈現(xiàn)不同程度基本均勻的棕黃色顆粒，反之為陰性。根據(jù)光鏡下染色，陽性細胞分布分為：陽性細胞數(shù)小于5%為-；陽性細胞數(shù)小于25%為+；陽性細胞數(shù)小于75%為++；陽性細胞數(shù)大于或等于75%為+++。

1.4.3 療效評估 采用改良Mayo評分，該評分系統(tǒng)主要包括4個項目，分別為：排便次數(shù)、便血、內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)、醫(yī)師總體評價，每個項目評分為0～3分。臨床緩解定義為評分小于或等于2分且無單個分項評分大于1 分；臨床有效定義為評分相對于基線值的降幅大于或等于30%及大于或等于3分，而且便血的分項評分降幅大于或等于1分或該分項評分為0或1分。無效定義為治療后評分相對于基線值的降幅小于30%或小于3分，或便血評分無改善。

1.4.4 質(zhì)量控制 所有病例收集人員均統(tǒng)一學習和掌握改良Mayo評分系統(tǒng)的評分方法。采用定式問卷、統(tǒng)一指導用語、統(tǒng)一填表方式來了解患者的排便次數(shù)、便血情況；內(nèi)鏡下黏膜表現(xiàn)由經(jīng)驗豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師評估；醫(yī)師總體評價由3名高年資主治醫(yī)師以上職稱的醫(yī)師共同評價；免疫組織化學所有切片遵循雙盲法由2名主治醫(yī)師以上的病理科醫(yī)師獨立觀察，細胞計數(shù)時均不顯示標本患者的臨床病理資料。

2 結(jié) 果

觀察組有2例因治療依從性差退出研究，2例因拒絕2周后復查腸鏡退出研究，實際完成21例；對照組有1例因服用柳氮磺吡啶后出現(xiàn)肝功能異常退出研究，2例因拒絕2周后復查腸鏡退出研究，實際完成22例。最終共有43例UC患者納入研究。

2.1 觀察組和對照組治療前與健康組大腸黏膜CX3CR1表達情況的比較 免疫組織化學結(jié)果顯示：健康組共有3例大腸黏膜陽性表達CX3CR1，陽性率為20.00%(3/15)，觀察組和對照組共有38例陽性表達CX3CR1，陽性率為88.37%(38/43)，見圖1。兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 觀察組和對照組與健康對照組大腸黏膜CX3CR1表達情況的比較(n)

A：正常大腸組織；B：UC大腸組織CX3CR1不同表達(+)；C：UC大腸組織CX3CR1不同表達(++)；D：UC大腸組織CX3CR1不同表達(+++)。

圖1 正常大腸組織及UC大腸組織中CX3CR1表達水平(SP×400)

表2 觀察組與對照組治療前后大腸黏膜CX3CR1的表達情況

2.2 觀察組與對照組治療前后大腸黏膜CX3CR1的表達情況 免疫組織化學結(jié)果顯示，治療前： 21例觀察組大腸黏膜組織切片中，-為2例，+為2例，++為7例，+++為10例；22例對照組大腸黏膜組織切片中，-為3例，+為2例，++為8例，+++為9例。治療后：21例觀察組大腸黏膜組織切片中，-為2例，+為10例，++為2例，+++為1例；22例對照組大腸黏膜組織切片中，-為4例，+為9例，++為6例，+++為3例。治療前兩組結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.469，P>0.05)。觀察組治療前后自身結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.990，P<0.01)；對照組治療前后自身結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.160，P<0.05)；治療后兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.291，P<0.05)，見表2。

2.3 觀察組與對照組患者臨床療效比較 治療2周后：觀察組21例患者中，14例患者獲得臨床緩解，4例患者臨床有效，3例無效，臨床緩解率為66.67%，臨床總有效率為85.71%，改良Mayo評分由治療前平均(7.86±1.91)分降為(2.86±2.10)分；對照組22例患者中，7例患者臨床緩解，9例患者獲得臨床有效，6例無效，臨床緩解率為31.82%，臨床總有效率72.73%，改良Mayo評分由治療前平均(7.91±1.80)分降為(4.27±2.39)分。改良Mayo評分經(jīng)t檢驗，兩組患者治療前評分結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，觀察組治療前后評分結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，對照組治療前后評分結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩組患者治療后評分結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。兩組完全緩解率比較經(jīng)χ2檢驗，觀察組明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.222，P<0.05)；兩組綜合療效經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗觀察組明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 觀察組與對照組治療前后改良Mayo評分比較

表4 觀察組與對照組綜合臨床療效比較

3 討 論

UC是一種原因尚不十分明確的結(jié)直腸慢性反復發(fā)作的非特異性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，缺乏特效治療方法，輕中度UC傳統(tǒng)治療多以氨基水楊酸制劑治療為主，部分治療效果不佳者需加用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療，上述藥物不良反應較多，停藥后容易復發(fā)，部分藥物治療效果差者甚至需要全結(jié)腸切除治療，患者非常痛苦，而病程漫長者癌變危險性也增加，因此探索UC新的治療方案具有重要意義。

參芪扶正注射液由黨參和黃芪組成，臨床上多用于輔助腫瘤治療及冠心病、心絞痛、肺心病、心力衰竭等心臟疾病的治療，在潰瘍性結(jié)腸炎治療方面鮮見報道。目前已有較多文獻已證實黨參和黃芪具有調(diào)節(jié)腸道菌群、腸道黏膜免疫等作用[1-5]。本研究結(jié)果表明，治療后觀察組改良Mayo評分結(jié)果明顯低于對照組，觀察組綜合療效及臨床緩解率明顯優(yōu)于對照組，可見“參芪扶正注射液聯(lián)合SASP”治療UC近期療效顯著，但參芪扶正注射液治療UC可能的藥物作用機制尚不明確。

目前研究表明，腸黏膜免疫屏障在炎癥性腸病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中始終發(fā)揮重要作用[13]。2005年Niess等[8]研究發(fā)現(xiàn)小腸黏膜固有層樹突狀細胞(DC)能通過依賴于CX3CR1調(diào)節(jié)的機制，形成跨上皮細胞的樹突，與腸腔中的細菌直接接觸，捕獲細菌抗原，引起一系列的腸道黏膜免疫反應。2011年，Medina-Contreras等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CX3CR1在調(diào)節(jié)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠炎癥性腸病腸道巨噬細胞動態(tài)平衡、細菌易位、致炎效應子Th17應答等方面具有重要作用。2014年，Longman等[14]亦證實，CX3CR1在調(diào)節(jié)腸道單核吞噬細胞捕獲細菌抗原方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)：UC患者治療前與健康組大腸黏膜CX3CR1表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明CX3CR1高表達于UC患者；治療后，觀察組與對照組大腸黏膜CX3CR1表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明參芪扶正注射液可能參與了CX3CR1的調(diào)控。因此，參芪扶正注射液治療UC的可能藥物機制為通過調(diào)控CX3CR1的表達來改善UC患者的腸黏膜免疫屏障。本研究由于時間及條件有限，樣本量偏小，今后應在本研究的基礎上進一步擴大樣本量。另外，由于參芪扶正注射液為靜脈類用藥，長期應用患者依從性較差，其遠期療效尚不明確，未來是否可通過開發(fā)參芪扶正口服制劑來治療UC有待研究。

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Effect of shenqifuzheng injection on CX3CR1 in colonic mucosa of patients with ulcerative colitis*

ZhaoChangdong1,ZhangXiaojie1△,ZhangLei2,LuoHongbo1,ChenXian1,ZhangHui1,ZhangYifeng1

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofPathology,theSecondPeople′sHospitalofLianyungangCity,AffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Lianyungang,Jiangsu222023,China)

ObjectiveTo observe the clinical efficacy of shenqifuzheng injection combined with sulfasalazine (SASP) in the treatment of ulcerative colitis (UC),and to evaluate the effect of CX3CR1 on colonic mucosa of UC in treatment with shenqifuzheng injection.MethodsFifty-one patients with active mild to moderate UC were collected during the period from January 2012 to June 2014 in the second people′s hospital of Lianyungang,which randomly divided into experimental group and control group,and setting up health group of 15 cases.Experimental group were treated with shenqifuzheng injection combined with SASP,control group were only with SASP,health group were no-treatment control.The modified Mayo scoring results and the expression of CX3CR1 on colonic mucosa of the same lesion site were observed before and two weeks after treatment separately.ResultsThe total positive rate of CX3CR1 on colonic mucosa in patients with ulcerative colitis was 88.37% before treatment,The total positive rate of CX3CR1 on colonic mucosa in health group was 20.00%,There was significant difference between two groups (Z=-2.689,P<0.01).Two weeks after treatment，the expression of CX3CR1 on colonic mucosa and the modified Mayo scoring results in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P<0.05).The clinical comprehensive efficacy of the experimental group was significantly better than the control group (Z=-2.085,P<0.05).ConclusionCombination of shenqifuzheng injection and SASP is more effective than using SASP alone in the treatment of UC.Shenqifuzheng injection may play important role in the treatment of UC by inhibiting the expression of CX3CR1 on colonic mucosa.

colitis，ulcerative;intestinal mucosa;shenqifuzheng injection;CX3CR1

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.022

蚌埠醫(yī)學院科技發(fā)展基金項目(Byky1288NF)。

：趙昌東(1978-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道疾病的診治?！?/p>

,Tel:13812337155;E-mail:lygzxjsyt@163.com。

R259

A

1671-8348(2015)29-4095-03

2015-04-21

2015-05-16)