白細(xì)胞介素基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性分析*

董 靜，陳 萍，劉 丹，呂艷欣，梅慶步，張明龍，鄭立紅

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000)

論著·臨床研究

白細(xì)胞介素基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性分析*

董 靜，陳 萍，劉 丹，呂艷欣，梅慶步，張明龍，鄭立紅△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000)

目的探討白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因多態(tài)性(SNPs)與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。方法采集齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附院乳腺癌患者血樣156例作為病例組，抽取健康者血樣156例作為對(duì)照組。經(jīng)過基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增等一系列反應(yīng)，使用時(shí)間飛行質(zhì)譜對(duì)IL-10-592、-1082位點(diǎn)進(jìn)行基因分型及多態(tài)性分析。最終通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析乳腺癌患者與健康者之間的差異。結(jié)果兩組的IL-10-592位點(diǎn)均存在C/C、C/A、A/A 3種基因型，比較分布不存在顯著差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.26，P>0.05)。兩組的IL-10-1082位點(diǎn)均存在G/G、G/A、A/A基因型，比較分布存在差異，病例組G/G、G/A基因型多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.07，P<0.01)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn)，與IL-10-592 A/A基因型比較，攜帶IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=1.039(95%CI：0.484～2.233)，P=0.922，OR：1.635(95%CI=0.683～3.915)，P=0.270，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與IL-10-1082 A/A比較，表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=0.424(95%CI：0.210～0.855)，P=0.016，OR=0.455(95%CI：0.178～1.163)，P=0.100。結(jié)論IL-10-592 位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與乳腺癌遺傳易感不相關(guān)。IL-10-1082 G/A基因型的表達(dá)可能是乳腺癌遺傳易感的一個(gè)保護(hù)因素。

白細(xì)胞介素10；乳腺腫瘤；基因多態(tài)性

全球乳腺癌發(fā)病率較高，據(jù)國家癌癥中心和國家衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局統(tǒng)計(jì)顯示[1]：乳腺癌發(fā)病率已占據(jù)女性惡性腫瘤第一位，且各地區(qū)發(fā)病率無明顯差異[2]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，但根據(jù)多項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)遺傳、免疫等均為乳腺癌的高危因素[3]。歐美等國家通過大量研究發(fā)現(xiàn)大量乳腺癌相關(guān)的易感基因，如BRCA-1/2、p53、PTEN等[4]。本次研究選擇了乳腺癌患者白細(xì)胞介素-10(IL-10)啟動(dòng)子區(qū)-592、-1082位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行研究，通過基因測(cè)序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以論證IL-10基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2013年1月至2014年6月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的乳腺癌患者血樣156例作為病例組，均為女性，平均年齡(45.73±7.69)歲。另采集同期體檢健康者血樣156例作為對(duì)照組，均為女性，平均年齡(43.91±7.16)歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)[5]及世界衛(wèi)生組織(WHO)[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。病例組中乳腺癌患者均為首次發(fā)現(xiàn)就診，經(jīng)病理學(xué)診斷確診，排除其他腫瘤類疾病。對(duì)照組既往均無乳腺腫瘤及其他類腫瘤疾病。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物制備 采集清晨空腹血1 mL，肝素抗凝，使用全血基因組小劑量試劑盒提取DNA后進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)及濃縮純化。根據(jù)IL-10的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，用iPLEX GOLD設(shè)定IL-10-592(rs1800872)、IL-10、-1082(rs1800896)的引物。見表1。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及單堿基延伸 使用7900PCR擴(kuò)增儀(ABI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系5.0 μL：MgCl2，0.5 μL，1×；底物混合物0.1 μL，2 mmol/L；引物混合物1.0 μL，100 nmol/L；反應(yīng)酶0.2 μL，1.0 U；水1.8 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃，900 s；94 ℃，20 s；56 ℃，30 s；72 ℃，60 s，45次循環(huán)；72 ℃，180 s；4 ℃存放。按照iPLEX GOLD建議[7]進(jìn)行單堿基延伸。

表1 引物序列表

1.2.3 飛行質(zhì)譜基因分型[8]PCR的產(chǎn)物在單堿基延伸后收集純化的DNA，使用SCMS-IT-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀進(jìn)行基因表型分析，SEQUENOM軟件對(duì)單堿基延伸產(chǎn)物質(zhì)譜峰位置確定分子質(zhì)量，得出SNP分型結(jié)果，并根據(jù)質(zhì)譜峰的信噪比、峰尖位置、峰寬度判定分型結(jié)果質(zhì)量值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較并分析基因型及等位基因分布。應(yīng)用Logistic多元回歸分析各基因型與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型及頻率分布 經(jīng)分析兩組的IL-10-592位點(diǎn)均存在C/C、C/A、A/A 3種基因型，比較分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.26，P>0.05)。兩組的IL-10-1082位點(diǎn)均存在G/G、G/A、A/A基因型，病例組G/G、G/A基因型多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.07，P<0.01)，見表2。

表2 基因型及頻率分布[n(%)]

2.2 基因型頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 本研究中所得的實(shí)際值，與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)病例組與對(duì)照組中各基因型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值分布不存在差異(P>0.05)，僅病例組中IL-10-1082位點(diǎn)基因型分布存在差異(P<0.05),基本符合Hardy-Weinberg 平衡，證實(shí)了本研究的群體符合遺傳學(xué)規(guī)律，具有代表性，見表3、表4。

2.3 各基因位點(diǎn)與乳腺癌遺傳易感相關(guān)性分析 對(duì)本研究中所得結(jié)果使用Logistic多元回歸分析，以驗(yàn)證IL-10-592與IL-10-1082各位點(diǎn)與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)性。與IL-10-592 A/A基因型比較，表達(dá)IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=1.039，95%CI：0.484～2.233，P=0.922，OR=1.635，95%CI：0.683～3.915，P=0.270，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與IL-10-1 082 A/A比較，表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=0.424，95%CI：0.210～0.855，P=0.016，OR=0.455，95%CI：0.178～1.163，P=0.100。即IL-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能降低乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，見表5、6。

表3 IL-10-592位點(diǎn)基因型頻率平衡檢驗(yàn)

表4 IL-10-1 082位點(diǎn)基因型頻率平衡檢驗(yàn)

表5 IL-10-592 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的危險(xiǎn)性分析

表6 IL-10-1082 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感的危險(xiǎn)性分析

3 討 論

乳腺癌作為全球高發(fā)的一類惡性腫瘤，其發(fā)病與遺傳、環(huán)境等因素關(guān)系密切，但其發(fā)病的分子機(jī)制尚未確切，對(duì)于細(xì)胞因子基因多態(tài)性的研究逐漸深入。IL-10屬于干擾素家族的細(xì)胞因子合成抑制因子，它可抑制Th1細(xì)胞合成干擾素-γ、TNF-α等[9-10]。其是一種具有免疫活力的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，具有刺激、抑制免疫的雙重作用[11-12]。其可增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖、分化，上調(diào)MHC-Ⅱ的表達(dá)，也可以抑制單核細(xì)胞MHC-Ⅱ的表達(dá)，下調(diào)T細(xì)胞活性。由于作用的靶細(xì)胞不同，IL-10表現(xiàn)出不同的效用，其雙向表現(xiàn)是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[13-14]。IL-10啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子，影響其水平的表達(dá)，因此啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性的研究是目前基礎(chǔ)研究的熱門[15-16]。

國內(nèi)外對(duì)于白細(xì)胞介素的研究眾多。方琦[17]在對(duì)原發(fā)性乳腺癌組織中IL-8的基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)IL-8相對(duì)表達(dá)高時(shí)乳腺癌患者生存期較短，且IL-8表達(dá)可能為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。劉繼永[18]發(fā)現(xiàn)IL-1B T-31C、C-511T的多態(tài)性改變可能會(huì)增加中國人群乳腺癌發(fā)病概率，在其多層分析中也發(fā)現(xiàn)月經(jīng)情況可能影響IL-8基因多態(tài)性與乳腺癌易感的關(guān)聯(lián)。宋新宇等[19]研究中發(fā)現(xiàn)IL-10可能通過抑制樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生及分化而抑制機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫作用。有文獻(xiàn)證實(shí)了IL-10在協(xié)助乳腺癌細(xì)胞逃脫免疫攻擊上可能起著重要作用[20]。相反的是，Smith等[21]研究闡述IL-10等細(xì)胞因子與乳腺癌的易感性無明顯關(guān)系。且張國強(qiáng)等[22]的Meta分析未能證明IL-10基因多態(tài)性與乳腺癌易感相關(guān)。

3.1 IL-10-592位點(diǎn)多態(tài)性分析 本研究中，分析結(jié)果顯示，在病例組中IL-10-592 C/C、C/A、A/A位點(diǎn)各基因型頻率分別為28.2%、50.0%、21.8%，與對(duì)照組比較無顯著差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn)，與IL-10-592 A/A基因型比較，表達(dá)IL-10-592 C/A、C/C基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=1.039，OR=1.635，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即細(xì)胞因子IL-10-592 位點(diǎn)多態(tài)性的改變可能與乳腺癌的易感不相關(guān)。而在相關(guān)研究領(lǐng)域中，Cheong等[23]發(fā)現(xiàn)IL-10啟動(dòng)子區(qū)-592 A等位基因與乙型肝炎易感可能相關(guān)。

3.2 IL-10-1082位點(diǎn)多態(tài)性分析 IL-10-1082位點(diǎn)多態(tài)性在乳腺癌患者與健康人群中分布各異，Giordani等[24]及Gonullu等[25]研究發(fā)現(xiàn)IL-10-1082位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌易感性相關(guān)，在病例組各基因型頻率與對(duì)照組比較，病例組G/G、G/A基因型多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在Logistic多元回歸分析中發(fā)現(xiàn)，與IL-10-1082 A/A比較，表達(dá)IL-10-1082 G/A、G/G基因型的群體發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性分別為OR=0.424，P=0.016，OR=0.455，P=0.100。表達(dá)IL-10-1082 G/A基因型患乳腺癌的概率是A/A基因型群體的0.424倍，G/A基因型為乳腺癌遺傳易感的保護(hù)因素，可以降低患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即細(xì)胞因子IL-10-1082 G/G基因型表達(dá)可能與乳腺癌易感不相關(guān)，而IL-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能降低乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。而Smith等[21]及Balasubramanian等[26]等研究結(jié)果卻相反，他們發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞因子與乳腺癌易感性無明顯關(guān)系。

綜上，本研究中并不能證明IL-10基因多態(tài)性的改變與乳腺癌遺傳易感相關(guān)，但I(xiàn)L-10-1082 G/A基因型表達(dá)可能是乳腺癌發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因素，這與既往IL-10-1082 G/A基因多態(tài)性在乳腺癌的易感性方面扮演某種角色的說法[27-28]相印證，而與張國強(qiáng)等[22]的Meta分析中的結(jié)果相悖。對(duì)于白細(xì)胞介素與乳腺癌遺傳易感的相關(guān)研究相對(duì)較少，樣本量較小也可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確度，對(duì)于二者的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

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Analysis of the relationship between interleukin SNPs and breast cancer susceptibility*

DongJing，ChenPing,LiuDan,LvYanxin,MeiQingbu,ZhangMinglong,ZhengLihong△

(DepartmentofBiologicalHeredity,QiqiHaerMedicalUniversity，QiqiHaer，Heilongjiang161000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between IL-10 SNPs and breast cancer susceptibility.MethodsCollected 156 blood samples of breast cancer patients as case group and 156 blood samples of health as control.Genotype SNPs of IL-10-592,-1082 were analyzed by genomic DNA extraction，PCR amplification and TOF mass spectrometry.The data was used by statistical analysis.ResultsIL-10-592 C/C,C/A and A/A site the genotype frequencies were not diversity between two groups(χ2=3.26，P>0.05).IL-10-1082 G/G、G/A、A/A site the genotype frequencies were statistically significant between two groups(χ2=14.07，P<0.01).In Logistic multivariate regression analysis found that：be compared with IL-10-592 A/A,carrying IL-10-592 C/A,C/C group respectively the risk of breast cancer wereOR=1.039(95%CI:0.484-2.233),P=0.922,OR=1.635(95%CI:0.683-3.915),P=0.270,which had no statistical significance.In Logistic multivariate regression analysis found that：be compared with IL-10-1082 A/A,carrying IL-10-1082 G/A、G/G group respectively the risk of breast cancer wereOR=0.424(95%CI:0.210-0.855),P=0.016,OR=0.455(95%CI:0.178-1.163),P=0.100.ConclusionIL-10-592 may be not associated with breast cancer susceptibility.IL-10-1082 G/A may be a protection factor with breast cancer susceptibility.

interleukin-10;breast neoplasms;gene polymorphism

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.019

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目(12541903)。

：董靜(1987-)，碩士，助教，主要從事抗腫瘤研究?！?/p>

，Tel:18045289390；E-mail:zhenglihong0zlh@sina.com。

R737.9

A

1671-8348(2015)29-4086-03

2015-04-18

2015-08-16)