人WJ-MHCs移植對心肌梗死后心力衰竭大鼠TNF-α 及NT-proBNP的影響*

梁曉輝,趙子粼，歐東波,羅建春,龔超奇，覃善都，趙東海，△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西桂林 541004；2.中國人民解放軍第303醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西南寧 530021；3.中國人民解放軍第422醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524005)

論著·基礎(chǔ)研究

人WJ-MHCs移植對心肌梗死后心力衰竭大鼠TNF-α 及NT-proBNP的影響*

梁曉輝1,趙子粼2，歐東波3,羅建春2,龔超奇2，覃善都2，趙東海1，2△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西桂林 541004；2.中國人民解放軍第303醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西南寧 530021；3.中國人民解放軍第422醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524005)

目的觀察人華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞(WJ-MHCs)對心肌梗死后心力衰竭大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)及N末端B型腦利鈉肽前體(NT-proBNP)的影響。方法采用80只雄性SD大鼠通過異丙腎上腺素多點皮下注射，劑量為200 mg/kg，隔24 h注射1次共2次。待大鼠存活1周建立模型后各取12只隨機(jī)均衡分入WJ-MHCs移植組、普通對照組、空白對照組各12只健康大鼠，3組再分為移植前和移植后4周兩個亞組。WJ-MHCs移植組于心肌梗死后1周移植以DAPI標(biāo)記的WJ-MHCs，空白對照組及普通對照組不做處理正常飼養(yǎng)。分別于移植前和移植后4周檢測大鼠心臟組織中TNF-α水平，移植后4周WJ-MHCs細(xì)胞在大鼠心臟中的情況，大鼠TNF-α和NT-proBNP的水平，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。結(jié)果移植后WJ-MHCs移植組較移植前LVEF明顯提高(P<0.05)，較移植前及普通對照組血清TNF-α及NT-proBNP明顯降低(P<0.05)；移植后WJ-MHCs移植組較普通對照組心臟組織中TNF-α表達(dá)明顯減少；WJ-MHCs移植組病死率(16.67%)較普通對照組病死率(33.33%)明顯降低；免疫熒光顯示移植后4周仍可檢測到移植的WJ-MHCs。結(jié)論移植人WJ-MHCs可明顯降低心梗后心衰大鼠心臟組織及循環(huán)中的TNF-α，降低循環(huán)中的NT-proBNP，提高心功能。

臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞；炎癥；心肌梗死；心力衰竭

Effect of human umbilical cord WJ-MHCs on TNF-α and NT-proBNP in the rats with heart failure of acute myocardial infarction*

LiangXiaohui1,ZhaoZilin2,OuDongbo3,LuoJianchun2,GongChaoqi2,QinShandu2,ZhaoDonghai1,2△

心肌梗死及其他原因?qū)е滦呐K損傷后，死亡及損傷的心肌細(xì)胞會引起心臟局部的無菌性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞趨化至炎癥部位，在清除損傷部位壞死細(xì)胞的同時會釋放大量炎性反應(yīng)介質(zhì)對仍存活的心肌細(xì)胞造成損傷及凋亡，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量及收縮能力的持續(xù)下降，從而引起心力衰竭，而TNF-α在其中起重要作用[1]。華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞(wharton′s jelly-mesenchymal stem cells,WJ-MHCs)為來源于臍帶的多能干細(xì)胞，擁有強(qiáng)大的增殖及免疫抑制能力[2]。本實驗將人WJ-MHCs移植入心肌梗死后心力衰竭的大鼠心臟中，探討其對心肌梗死后心力衰竭大鼠炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)及N末端B型腦利鈉肽前體(NT-proBNP)的影響。

表1 人WJ-MHCs移植前、移植后4周3組大鼠心功能及血清TNF-α和NT-proBNP變化

A、D：空白對照組；B、E：普通對照組；C、F：人WJ-MHCs移植組。

圖1 各組大鼠心臟組織HE切片(×100)

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 采用SD大鼠(購自廣西壯族自治區(qū)疾病與預(yù)防控制中心)共80只，均為雄性，體質(zhì)量190～220 g，建立模型后各取12只隨機(jī)均衡分入WJ-MHCs移植組和普通對照組，取12只健康大鼠作為空白對照組，然后3組再分為移植前組和移植后4周兩個亞組，WJ-MHCs移植組移植WJ-MHCs，對照組不做處理，正常飼養(yǎng)。WJ-MHCs由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院制備及提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 取體質(zhì)量為190～220 g雄性SD大鼠，按照參考文獻(xiàn)[3]報道的方法復(fù)制心肌梗死模型：每只大鼠按200 mg/kg劑量多點皮下注射異丙腎上腺素，隔24 h注射1次共2次，注射完畢后正常飼養(yǎng)，待注射完畢后大鼠成功存活1周,心肌梗死后心力衰竭模型即制作成功。

1.2.2 人WJ-MHCs的標(biāo)記 將培養(yǎng)基吸出，把含有 DAPI(武漢博士德 AR1177) 的DMEM-LG(上海慧穎 31600034) 加入培養(yǎng)瓶中，37 ℃下孵育 30 min，吸出培養(yǎng)基，用 PBS溶液沖洗 6 遍，以洗去未結(jié)合的 DAPI，再加入 0.25%的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞消化脫壁后，用等量的含血清培養(yǎng)基中止消化。吸出細(xì)胞懸液，離心1 000 r/min，5 min，吸出上清液，加入 PBS 洗滌 1 次，重復(fù)離心1次，用無血清的 DMEM 懸浮細(xì)胞至細(xì)胞濃度為1×106/mL，置于冰上 1 h內(nèi)備用，標(biāo)記過程注意避光。

1.2.3 WJ-MHCs移植 模型制作成功后，實驗組大鼠麻醉后固定于動物手術(shù)臺上尋找心尖搏動最強(qiáng)點，將1 mL細(xì)胞懸液直接通過心尖搏動最強(qiáng)點緩慢注入心室(達(dá)到滿意位置后用注射器稍回抽，如見鮮紅色血液瞬間進(jìn)入注射器即示注射位置成功)，完畢后用無菌紗布輕微按壓注射部位，0.5 h后待大鼠完全蘇醒后放回鼠籠精心飼養(yǎng)。

1.2.4 心功能的檢測 分別于人WJ-MHCs移植前和移植后4周腹腔注射麻醉，左胸前部剃毛，采用超聲心動圖儀檢測搏出量占心室舒張末期容積的百分比，即左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,LVEF)。每一數(shù)據(jù)均測量3次，取其均值。

1.2.5 心臟標(biāo)本取材 心功能檢測完畢后，于WJ-MHCs移植4周后麻醉大鼠，心腔內(nèi)注射10%的氯化鉀溶液1 mL，使心臟停止于舒張期，迅速取出心臟，去除心臟表面多余組織，冰鹽水洗凈，以備免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測。

1.2.6 免疫組織化學(xué)及檢測

1.2.6.1 免疫熒光檢測 完成心臟標(biāo)本取材后沿心臟短軸方向?qū)⒆笮氖仪邢卵b入-80 ℃冰箱中保存，待切片時取出，室溫下解凍后在恒冷冰凍切片機(jī)上將組織塊切成6～8 μm厚度的切片。冰凍切片在室溫下避光放置20～30 min風(fēng)干，在免疫熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞情況。

1.2.6.2 免疫組織化學(xué)檢測 完成心臟標(biāo)本取材后，將待測心臟標(biāo)本在40 g/L甲醛溶液中固定24 h，隨后進(jìn)行脫水，透明，浸蠟和包埋，垂直于心臟長軸連續(xù)切片，厚度3 μm，使用TNF-α(武漢博士德 BA0131)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察其表達(dá)情況。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附測定 在取出心臟標(biāo)本前，通過心臟取出2 mL靜脈血分別用大鼠TNF-α試劑盒(武漢博士德 EK0526)和NT-proBNP(上海藍(lán)基 E02N0008)試劑盒檢測血清中TNF-α和NT-proBNP的情況。

2 結(jié) 果

2.1 移植前后TNF-α與NT-proBNP變化 表1結(jié)果顯示普通對照組和人WJ-MCHs移植組在細(xì)胞移植前LVEF較空白對照組明顯降低，TNF-α及NT-proBNP均較空白對照組明顯升高。WJ-MCHs移植組在細(xì)胞移植后LVEF較移植前明顯提高，TNF-α及NT-proBNP較普通對照組及移植前明顯降低同時其病死率較普通對照組低(16.67%vs. 33.33%)。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 結(jié)果顯示模型制作成功后心臟組織中心肌細(xì)胞大量壞死，壞死區(qū)域淋巴細(xì)胞浸潤(圖1A)顯著同時心梗區(qū)域TNF-α表達(dá)明顯增加(圖1D)；移植WJ-MHCs 4周后WJ-MCHs移植組(圖1C)較普通對照組(圖1B)心肌梗死區(qū)及淋巴細(xì)胞浸潤減少WJ-MCHs移植組(圖1F)較普通對照組(圖1E)TNF-α表達(dá)減少。

2.3 免疫熒光結(jié)果顯示 移植WJ-MHCs 4周后，WJ-MHCs在心臟組織中仍然存活，見圖2。

圖2 大鼠移植WJ-MHCs 4周后心臟組織免疫熒光切片(×100)

3 討 論

心力衰竭的主要機(jī)制是各種原因?qū)е碌男募〖?xì)胞損傷、死亡，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致心臟泵功能下降。最近的研究證實，心肌損傷及死亡后導(dǎo)致的心臟局部炎性反應(yīng)是心力衰竭發(fā)生機(jī)發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[4]。而在心臟炎性反應(yīng)中，炎癥因子既是使動因素,因其可以使炎癥細(xì)胞趨化至炎癥部位，又是維持和效應(yīng)因子,因其可使趨化至炎癥部位的炎癥細(xì)胞增殖及活化釋放炎癥因子,持續(xù)損傷炎癥部位存活的細(xì)胞及刺激纖維結(jié)締組織增生，使心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致心臟重構(gòu)[5-7]。一般認(rèn)為TNF-α越高，炎性反應(yīng)越強(qiáng)烈。而TNF-α在心臟炎癥導(dǎo)致的心室重構(gòu)過程中起重要的作用，Kubota等[8]通過將TNF-α基因?qū)胄∈螃良∏虻鞍字劓準(zhǔn)剐∈笮呐K高度表達(dá)TNF-α而制成TNF-α轉(zhuǎn)基因大鼠，將其正常飼養(yǎng)后出現(xiàn)心室肥大及擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、LVEF下降及β1受體數(shù)量減少等。因此將TNF-α作為判斷心力衰竭遠(yuǎn)期預(yù)后的影響因子是合適的[9]。

雖然MSCs有很強(qiáng)的增殖及分化能力,但是目前仍沒有證據(jù)表明其可以在心臟中分化為心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]，本研究結(jié)果顯示在移植人WJ-MHCs后，心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能較移植前明顯提高，且較普通對照組顯著提高，說明通過人WJ-MHCs移植治療心肌梗死后心力衰竭是有效的。但根據(jù)目前研究顯示，心力衰竭大鼠心功能的獲益與人WJ-MHCs定向分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞無關(guān)，因此心力衰竭大鼠心功能的提高并非獲益于心肌細(xì)胞數(shù)量增加引起的心肌收縮能力提高。本研究同時顯示在移植WJ-MHCs后，心臟局部及循環(huán)中TNF-α較移植前明顯減少，因此心力衰竭大鼠心功能的提高與WJ-MHCs移植后抑制心臟局部炎癥有關(guān)。目前已經(jīng)有研究證實，免疫細(xì)胞可以識別和殺傷應(yīng)激細(xì)胞，比如心肌梗死后存活的心肌細(xì)胞[6]，同時心肌梗死及其他原因?qū)е碌男募〖?xì)胞死亡后，心臟自身抗原被免疫系統(tǒng)識別，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)持續(xù)對心肌細(xì)胞造成損傷[11]。研究顯示W(wǎng)J-MHCs比其他成人間充質(zhì)干細(xì)胞比如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擁有更強(qiáng)的免疫抑制能力[12]，因此作者選擇WJ-MHCs進(jìn)行移植，研究結(jié)果顯示移植后心肌梗死后心衰大鼠循環(huán)及心臟中的TNF-α均較移植前及普通對照組明顯減少，移植后心梗區(qū)域炎癥浸潤較移植前及普通對照組明顯減輕，同時大鼠心功能得到提高，移植4周后仍可在大鼠心臟標(biāo)本中檢測到移植細(xì)胞，說明移植后細(xì)胞長期在心臟中存活并發(fā)揮作用。因此認(rèn)為通過人WJ-MHCs移植可以改善心臟炎性反應(yīng)，而且移植后心功能以及NT-proBNP均較移植前及普通對照組明顯改善，因此WJ-MHCs移植治療心力衰竭是有效的。

BNP又稱為腦鈉尿肽，為左室功能不全使心肌細(xì)胞釋放入血的一種天然激素，為臨床反映心力衰竭的敏感指標(biāo)，但其半衰期較短，NT-proBNP，來源于BNP相同但無生物活性，其比BNP半衰期稍長更易于臨床檢測[13]。因此NT-proBNP更反映心力衰竭當(dāng)時的嚴(yán)重程度，而TNF-α反映的則是心臟炎癥程度，本實驗中普通對照組較移植組病死率增高，也說明心臟炎癥更能反映心力衰竭的遠(yuǎn)期預(yù)后，本研究結(jié)果顯示移植后NT-proBNP和TNF-α均較移植前及普通對照組明顯下降，因此通過WJ-MHCs移植不僅可以短期改善心衰，更可治療心臟炎癥對心肌細(xì)胞的持續(xù)損傷而改善心力衰竭的長期預(yù)后。

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(1.GraduateCollege,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541004,China;2.Department

ofCardiology,No.303HospitalofPLA,Nanning,Guangxi530021,China;3.DepartmentofCardiology,

No.422HospitalofPLA,Zhanjiang,Guangdong524005,China)

ObjectiveTo observe the influence of human umbilical cord wharton′s jelly-mesenchymal stem cells(WJ-MHCs) on the tumor necrosis factor α (TNF-α) and N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) in rats with heart failure of acute myocardial infarction.MethodsTotally 80 male rat models of heart failure of acute myocardial infarction were made by isoprenaline(ISO) 200 mg/kg injected subcutaneously twice at an interval of 24 hours.After one week,24 survival rats were randomly divided into WJ-MHCs transplantation group and normal control group.Sham group was made of 12 health rats,and then each of the three groups was subdivided into pre-transplantation group and post-transplantation group 4 weeks later.WJ-MHCs transplantation group was transplanted with WJ-MHCs with DAPI labeled after ISO injected one week.Sham group and normal group were untreated and normally bred.The left ventricular ejection fraction(LVEF) measured by before transplantation and post-transplantation 4 weeks later.The injected cells and the expression of TNF-α was measured.ResultsCompared to pre-transplantation group,WJ-MHCs transplantation group increased the LVEF(P<0.05);compared to pre-transplantation and normal control,WJ-MHCs transplantation group reduced the TNF-α and NT-proBNP in the serum(P<0.05)and the expression of TNF-α from the heart tissue(P<0.05);compared to normal transplantation,WJ-MHCs transplantation group reduced the mortality from 33.3% to 16.7%；immunofluorescence demonstrated that transplanted cells were still found alive in the heart after transplantation 4 weeks later.ConclusionTransplantation of WJ-MHCS down-regulates TNF-α and NT-proBNP in the serum in the serum and the expression of TNF-α from the heart tissue and up-regulates the LVEF in rats with heart failure of acute myocardial infarction.

umbilical cord wharton′s jelly-mesenchymal stem cells;inflammation;myocardial infarction;heart failure

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.015

廣西壯族自治區(qū)自籌經(jīng)費科研課題(Z2013542)。

：染曉輝(1988-)，碩士，醫(yī)師，主要從事臍帶干細(xì)胞的研究。△

，Tel:18577769775；E-mail:303yz@sina.com。

R541.6;R542.2+2

A

1671-8348(2015)29-4073-04

2015-04-25

2015-06-16)