CDX2基因在成人急性髓細胞白血病中的表達及臨床意義*

申淑珍，劉 娟，馬 云，楊 瑞，許 飛，李 玲，白曉川

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科，銀川 750004)

論著·臨床研究

CDX2基因在成人急性髓細胞白血病中的表達及臨床意義*

申淑珍，劉 娟，馬 云，楊 瑞，許 飛，李 玲，白曉川

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科，銀川 750004)

目的研究尾型同源盒基因2(CDX2)在急性髓細胞白血病(AML)患者中的表達及臨床意義。方法通過RT-PCR方法檢測114例初發(fā)AML患者及56例誘導化療后患者骨髓和(或)外周靜脈血單個核細胞CDX2基因表達，19例隨訪患者每3個月定期檢測CDX2基因表達。8名健康者外周靜脈血和5名缺鐵性貧血患者骨髓作為對照。結果114例AML患者和13名對照的骨髓和(或)外周血單個核細胞均檢測到CDX2基因表達。以第一個四分位數為界劃分低表達組和高表達組，對照組CDX2基因表達水平均在低表達組，114例AML患者高表達組90例(78.9%)，對照組與AML患者CDX2基因表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。初發(fā)患者骨髓和外周靜脈血CDX2基因表達呈正相關(r=0.656,P<0.01)。CDX2高低表達組誘導化療完全緩解(CR)率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本組AML病例CDX2高表達78.9%。CR患者CDX2表達量為化療前的10.3%～86.2%，且隨著療程增加逐步降低，復發(fā)時顯著升高。隨訪6個月以上病例19例，兩組早期復發(fā)率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論CDX2表達量變化反映患者體內白血病細胞負荷，持續(xù)高表達可能是預后不良指標之一，可作為染色體核型正常AML微小殘留病監(jiān)測指標。

CDX2；白血病，髓細胞，急性；預后；微小殘留白血病

尾型同源盒基因2(CDX2)在急性髓細胞白血病(AML)中表達最早是Chase等[1]1999年報道的，同時提示CDX2基因在白血病中的表達可能參與了白血病的發(fā)生。Scholl等[2]研究提示成人白血病中存在胚胎通路的激活，CDX2是同源盒基因(HOX)家族成員，是促進胚胎發(fā)育和早期造血發(fā)育的主控基因，通過胚胎通路的激活,導致成人急性白血病。在AML發(fā)病中起的是原癌基因的作用，CDX2基因表達上調后通過增強造血祖細胞的自我更新能力而使細胞獲得了潛在的致白血病性。本文通過檢測初發(fā)及誘導化療后AML患者骨髓及(或)外周靜脈血中CDX2表達，19例AML(非急性早幼粒細胞白血病)隨訪超過6個月，每3個月檢測骨髓和(或)外周靜脈血單個核細胞CDX2基因表達。探討其與AML患者臨床及預后、微小殘留白血病(MRD)的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2011年8月至2014年8月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科住院患者，經骨髓形態(tài)學及組織化學、免疫表型檢查確診初治 AML 患者 114例,診斷及療效標準依據張之南等[3]的《血液病診斷及療效標準》。男76 例,女38 例,年齡16～78歲,就診平均年齡43.9歲。完成常規(guī)標準方案(TA或IA)化療1個周期可供療效評估。對照為8名身體健康血液科工作人員外周靜脈血和5名缺鐵性貧血(IDA)患者骨髓。隨訪截止2014年12月。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol、PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)和Premix EX Taq(Perfect Real Time) (大連TaKaRa生物工程公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物設計和合成 基因序列從GenBank中獲取，引物用Primer5.0軟件進行設計。由上海閃晶生物技術有限公司合成。CDX2基因上游引物5′-TTC AGA ACC GCA GAG CAA AG-3′，下游引物5′-CCC AGG GAC AGA GCC AGA C-3′；內參基因GAPDH上游引物5′-CCA TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC A-3′，下游引物5′-GCC AGT AGA GGC AGG GAT GAT GTT C-3′。

1.3.2 單個核細胞提取 采集患者和對照者骨髓、靜脈血，EDTA抗凝，加入淋巴細胞分離液，按說明書分離并收集單個核細胞。

1.3.3 RNA提取和cDNA合成 提取患者和對照骨髓及全血的單個核細胞用Trizol試劑，按說明書所附提取步驟提取mRNA，用微量分光光度計(NanoDrop,Thermo)定量,OD260/280比值在1.8～2.0,于-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應。總體系20 μL：2×RTmix液10 μL，模板RNA 100～500 ng,加RNase free水至總體積20 μL；反應條件：37 ℃ 16 min，85 ℃ 5 s。

1.3.4 RT-PCR 所有基因RT-PCR按照試劑盒配制定量PCR反應體系。在20 μL反應體系中含2×PCR Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL(2.5 μmol/L),RoxⅡ 0.4 μL,cDNA反應產物2 μL,加入RNasefree水補足至20 μL。在ABI 7500 Fast上進行定量反應，反應條件為95 ℃ 30 s變性,95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,50個循環(huán)。每個樣本均設3個復孔，取平均值用于結果統(tǒng)計。

1.3.5 基因mRNA表達水平相對定量與分析 反應結束后，ABI7300 SDS Software自動分析熒光信號并將其轉換Ct值。Ct值取3個復管的平均值?！鰿t為目的基因Ct值與內參Ct值的差值。

1.3.6 CDX2基因表達水平的計算方法 CDX2基因表達量=2-△△Ct(△△Ct=△Ct患者-△Ct健康對照)×107。

1.3.7 CDX2基因表達四分位數劃分 CDX2基因表達量根據統(tǒng)計學中四分位數Q1,Q2和Q3結合健康人表達水平來劃分高低表達組,低于Q1的為低表達組,>Q1的為高表達組。

2 結 果

2.1 CDX2基因表達情況 114例AML患者血和骨髓及對照組骨髓或靜脈血均檢測到CDX2基因表達，114例AML患者骨髓中位表達水平為620.02(1.17～5 672 670.61)，血中位表達水平為647.33(3.22～8 213 486.54)，骨髓和血CDX2基因表達具有正相關(r=0.656,P<0.01)。對照組CDX2基因mRNA表達水平相對定量與AML CDX2基因mRNA表達水平相對定量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 CDX2基因表達與臨床特征相關性 114例AML患者骨髓低表達組24例(表達范圍1.17～175.19)，高表達組90例(175.19～5 672 670.61)，占AML病例78.9%。男性患者高表達81.6%，女性患者高表達73.7%，年齡大于或等于60歲組高表達87.0%，<60歲組高表達76.9%，白細胞數大于或等于30×109/L組高表達85.0%，白細胞數小于30×109/L組高表達75.7%，乳酸脫氫酶大于或等于1 000 U/L組高表達82.2%，乳酸脫氫酶小于1 000 U/L組高表達76.8%，免疫表型CD34+的病例組高表達72.0%，CD34-的病例組高表達92.3%，CD7+病例組高表達83.0%，CD7-病例組高表達70.2%，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在FAB分型中高表達分別為AML-M0 100%，AML-M1 89.3%，AML-M2 65.5%，AML-M3 25.0%，AML-M4 78.6%，AML-M5 84.6%，AML-M6 100%，淋髓混合病例高表達100%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。染色體正常核型組高表達78.3%，預后良好核型組高表達55.0%，預后不良核型組高表達90.9%，其他核型組高表達81.8%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 CDX2表達與誘導緩解率的關系 114例AML患者中有56例(非急性早幼粒細胞白血病)完成誘導化療，骨髓細胞形態(tài)學完全緩解(CR)37例，其中CDX2低表達11例(29.7%)，CDX2高表達26例(70.3%)；骨髓細胞形態(tài)學未緩解(NR) 19例，其中CDX2低表達3例(15.8%)，CDX2高表達16例(84.2%)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 AML患者CDX2基因表達與臨床特征、治療反應相關性[n(%)]

續(xù)表1 AML患者CDX2基因表達與臨床特征、治療反應相關性[n(%)]

2.4 誘導化療前后CDX2表達變化 37例誘導化療達CR病例CDX2表達較化療前均有不同程度降低，化療后CDX2表達量為化療前的10.3%～86.2%；19例誘導化療NR病例中，CDX2表達量較化療前有不同程度升高6例，余13例CDX2表達較化療前不同程度降低。

2.5 隨訪病例治療過程中CDX2表達變化 隨訪6個月以上病例19例，其中CDX2高表達15例，誘導化療1個療程達CR 12例，誘導化療2個療程達CR 3例。CDX2低表達2例誘導化療1個療程達CR。CR后CDX2表達量隨化療療程次數增加逐步下降，復發(fā)時再次顯著升高，且有2例隨訪超過2年復發(fā)病例，CDX2升高早于FCM檢測MRD及骨髓細胞形態(tài)學。持續(xù)不緩解2例，CDX2表達量逐步升高，死亡前CDX2表達量分別是初發(fā)時的60倍及100余倍。

3 討 論

AML是高度異質性的血液系統(tǒng)腫瘤，影響預后的因素包括臨床特點、白血病類型、免疫學、遺傳學、分子生物學及治療反應、微小殘留等。MRD的檢測對患者的再評估及危險度再分層至關重要[4]。監(jiān)測MRD的方法主要有PCR、流式細胞免疫分析(FCM)及FISH。其中定量PCR通過檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，靈敏度可達10-6，且費用顯著低于FCM及FISH的檢測費用,但基因定量需要患者有特異性基因標記。約60%的AML患者有核型異常，預后良好的核型t(15;17)形成的PML/RARa融合基因、t(8;21)形成的AML1/ETO融合基因、inv(16)、t(16;16)形成的CBFB/MYH11融合基因，占成人AML患者25%；而對于t(8;21)合并del(9q)、-Y及復雜核型、MLLT4、MLLT10等均提示預后不良；約40%的AML患者為正常核型，近些年新發(fā)現的與AML預后相關分子生物學指標如FLT3、NPM1、CEBPA、IDH等在正常核型AML患者中陽性率分別為23%、50%、10%、15%[4]。新近研究發(fā)現，在大多數的急性白血病(AL)患者CDX2廣泛高表達，CDX2表達與AL患者白血病細胞負荷,MRD成正相關[5]。

本文通過RT-PCR方法檢測了初發(fā)成人AML患者(靜脈血和骨髓)及健康者靜脈血、IDA患者骨髓CDX2基因mRNA表達水平，均有表達，但健康者及IDA患者表達水平均低，與AML患者的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。本組AML病例CDX2基因高表達78.9%。在以性別、年齡、FAB分型、白細胞、乳酸脫氫酶分組的CDX2高表達、低表達之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與陸瀅等[6]研究相符。但CDX2基因在高白細胞數組高表達85.0%,乳酸脫氫酶大于或等于1 000 U/L組高表達82.2%，CD7+病例高表達83.0%；AML-M0 高表達100.0%，AML-M5 高表達84.6%，AML-M6 高表達100.0%，淋髓混合高表達100%，預后不良核型組高表達90.9%；而預后好的AML-M3高表達25.0%，預后良好核型組高表達55.0%。高白細胞、乳酸脫氫酶升高、FAB分型AML-M4、-M5、-M6、髓淋混合和染色體預后不良核型均是影響預后不良指標。隨訪持續(xù)不緩解2例患者，CDX2表達逐步升高，死亡前CDX2表達量分別是初發(fā)時的60倍及100余倍。均提示CDX2高表達可能與白血病細胞高負荷和預后不良相關，還需更多的病例研究去證實。

本組病例統(tǒng)計顯示CDX2高表達不影響AML誘導緩解率及早期復發(fā)率，這與黎國偉等[7]研究結果相符?；熀驝R患者CDX2表達量較化療前均有不同程度降低，隨訪6個月以上病例19例，隨著化療療程增加CDX2表達逐步降低，復發(fā)時顯著升高。有2例隨訪超過2年復發(fā)病例，CDX2基因表達量升高早于流式細胞儀(FCM)檢測白血病微小殘留及骨髓細胞形態(tài)學，且染色體正常核型組CDX2高表達78.3%。提示可和FCM監(jiān)測白血病相關免疫表型結合,作為染色體核型正常、無其他分子生物學異常標記AML患者的MRD監(jiān)測。同時本組病例提示AML患者骨髓和外周靜脈血均表達CDX2基因，且具有高度正相關，這與李迎俠等[8]研究結果相同，可用外周靜脈血代替骨髓檢測CDX2基因表達。但本研究連續(xù)觀察病例數量少，CDX2基因作為染色體核型正常AML患者MRD監(jiān)測的臨床意義，外周靜脈血代替骨髓作為MRD監(jiān)測的可靠性，還有待大宗病例的進一步觀察。

[1]Chase A,Reiter A,Burci L,et al.Fusion of ETV6 to the caudal-related homeobox gene CDX2 in acute myeloid leukemia with the t(12;13)(p13;q12)[J].Blood,1999,93(3):1025-1031.

[2]Scholl C,Bansal D,D?hner K,et al.The homeobox gene CDX2 is aberrantly expressed in most cases of acute myeloid leukemia and promotes leukemogenesis[J].J Clin Invest,2007,117(4):1037-1048.

[3]張之南，沈悌．血液病診斷及療效標準[M]．天津：天津科學技術出版社，1991：P116-P121．

[4]潘登．急性髓細胞白血病預后因素研究進展[J]．癌癥進展，2012，10(4)：360-363．

[5]李迎俠CDX2基因與白血病關系的研究進展[J].國際兒科學雜志,2011,38(1):85-87.

[6]陸瀅，汪瓊，牧啟田，等．CDX2基因在初發(fā)急性髓細胞白血病患者中的表達及臨床意義[J]．中華血液學雜志，2012，33(10)：835-838．

[7]黎國偉，王東寧，葉玉蝶，等．急性髓細胞白血病CDX2基因表達及臨床意義的探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2009，16(16)：1253-1255．

[8]李迎俠，黃嘉莉，錢新宏，等．兒童急性白血病CDX2基因WT1基因表達及其臨床意義對照研究[J]．中國實用兒科雜志，2013，28(3)：195-199．

Expression and clinical significance of CDX2 gene in adult acute myeloid leukemia*

ShenShuzhen,LiuJuan,MaYun,YangRui,XuFei,LiLing,BaiXiaochuan

(DepartmentofHematology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of caudal homeobox gene CDX2 in acute myeloid leukemia(AML) patients.MethodsBone marrow (BM)and peripheral blood (PB)samples were colleted in 114 cases of donor AML patients and 56 patients undergoing chemotherapy.The CDX2 gene expression in every patient′s mononuclera cells were detected by RT-PCR.Among these patients,19 cases were detected the gene continuous every three months.Eight healthy PB and five patients with iron deficiency anemia BM as control.ResultsCDX2 gene transcript levels were detectable in bone marrow mononuclear cells from 114 AML patients and 13 healthy donors,but the level of gene expression was higher in AML patients(90/114,78.9%).There was a statistically significant difference between the AML patients and normal donor (P<0.01).The higher or lower expression of CDX2 gene showed no correlation with CR rate.CDX2 gene expression level had a positive correlation in BM and PB mononuclera cells(the correlation coefficientr=0.656,P<0.01).The expression of CDX2 in patients with CR was 10.3%-86.2% of pre-chemotherapy，wihch decreased with the treatment course，while elevated in recurrence. 19 cases of patients underwent half a year of follow-up，there was no significant difference of the rate of early recurrence in two groups(P>0.05).ConclusionHigher expression level of CDX2 gene is mostly in AML patients,but its expression has no relation with CR rate.CDX2 gene may be a prognostic molecular marker in AML patients,and can be used to monitor the minimal residual disease of Normal chromosome karyotype AML.

CDX2;leukemia,myeloid,acute;prognosis;minimal residual disease

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.004

2012年寧夏回族自治區(qū)科技攻關項目。

：申淑珍(1969-)，碩士，主任醫(yī)師，主要從事血液內科專業(yè)工作。

R733.71

A

1671-8348(2015)29-4042-03

2015-04-25

2015-08-16)