分化抑制因子1蛋白和基因在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的表達(dá)及意義*

任明強(qiáng)，袁 鐘，蘇 俊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1血液科;2.病理科，貴州遵義 563003)

論著·臨床研究

分化抑制因子1蛋白和基因在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的表達(dá)及意義*

任明強(qiáng)1，袁 鐘1，蘇 俊2

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1血液科;2.病理科，貴州遵義 563003)

目的觀察彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)組織中分化抑制因子1(Id1)蛋白以及骨髓細(xì)胞中Id1基因的表達(dá)水平，探討Id1在評價DLBCL患者病情及預(yù)后的臨床意義。方法收集2011年10月至2014年10月該院收治的初治DLBCL患者40例為觀察組，同期淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(RH)的初治患者25例為對照組。采用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測Id1在DLBCL組織和RH組織中的表達(dá)水平；采用RT-PCR法分別檢測Id1 mRNA在兩組患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果觀察組DLBCL組織切片Id1蛋白陽性表達(dá)率為75.00%(30/40)，而對照組RH組織切片中Id1蛋白陽性表達(dá)率為32.00%(8/25)。Id1蛋白在觀察組中表達(dá)水平明顯高于對照組(P=0.001)，觀察組中的Id1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，與臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)高低、結(jié)外器官受累情況等影響患者預(yù)后的指標(biāo)有關(guān)(P<0.05)。Id1基因在觀察組患者的骨髓細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于對照組患者骨髓細(xì)胞(Id1 mRNA水平2.80±0.87vs. 1.37±0.51，P<0.05)，且也與臨床分期、LDH高低、結(jié)外器官受累情況有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論Id1蛋白及Id1 mRNA在DLBCL組織以及骨髓中的表達(dá)較RH組織均明顯增高，與DLBCL病情預(yù)后有關(guān)，可能作為未來DLBCL治療的靶點(diǎn)。

淋巴瘤,大B細(xì)胞,彌漫性；淋巴組織增殖性疾?。环只种埔蜃?

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphomas，DLBCL)作為非霍奇金淋巴瘤最為常見的亞型，占到非霍奇金淋巴瘤的35%～40%[1]，屬于侵襲性淋巴瘤。近年來，伴隨對DLBCL發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，部分分子生物學(xué)指標(biāo)可能起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，分化抑制因子1(Id1)能夠負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，阻止細(xì)胞的正常分化，同時促進(jìn)其增殖,以及腫瘤血管的形成,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本文采用免疫組織化學(xué)S-P法和RT-PCR法分別檢測Id1蛋白在組織以及Id1基因在骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平，以探討Id1評價DLBCL患者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月至2014年10月本院病理科確診的DLBCL初治患者40例為觀察組，其中男22例，女18例，年齡19～67歲，中位年齡43歲。淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)25例，淋巴結(jié)外15例(7例侵犯骨髓)。臨床分期根據(jù)Ann Arbor-Colswolds分期標(biāo)準(zhǔn)[2]，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期13例，Ⅳ期7例。另取同時期淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(RH)的初治患者25例為對照組，男12例，女13例，年齡21～65歲，中位年齡46歲。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，并切取2 μm厚度切片。同時經(jīng)患者同意后，對本研究全部65例患者取骨髓標(biāo)本。40例DLBCL患者均接受以標(biāo)準(zhǔn)CHOP±R方案為主的正規(guī)聯(lián)合化療。

1.2 主要試劑 Anti-Id1抗體[EPR7098]，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(基因科技上海有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法 嚴(yán)格參照Anti-Id1抗體[EPR7098]以及GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。采用反應(yīng)性淋巴結(jié)增生病理標(biāo)本作為陰性對照，Anti-Id1抗體[EPR7098]的陽性對照為已知的乳腺癌病理標(biāo)本。步驟如下：切片-烤片-二甲苯Ⅰ10 min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇-90%乙醇-80%乙醇-70%乙醇-過氧化氫10 min-蒸餾水沖洗-檸檬酸高壓修復(fù)-冷卻后山羊血清封閉20 min-Anti-Id1抗體，4 ℃冰箱過夜-用PBS沖洗(3 min×3次) -滴加A液(HRP標(biāo)記聚合物)室溫孵育30 min-PBS沖洗(3 min×3次) -DAB顯色劑顯色后，沖洗，蘇木素復(fù)染并脫水，烤干后封片。

1.3.2 RT-PCR法 根據(jù)Genbank中報道的人Id1的基因序列,用Primer Pre-mier5.0軟件設(shè)計Id1基因的引物序列。上游引物為5′-AGG TAA ACG TGC TGC TCT ACG AC-3′,下游引物為3′-TTG CTC ACC TTG CGG TTC T-5′,長度91 bp。以β-actin為內(nèi)參照,設(shè)計特異性序列引物。上游引物為5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′,下游引物為5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′,長度186 bp。引物均由大連寶生物工程公司合成。取患者相應(yīng)骨髓5 mL,用肝素抗凝后,使用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞,并計數(shù)(5～10)×106細(xì)胞與Trizol總RNA提取液1 mL混勻，凍存與-20 ℃環(huán)境中。采用Trizol法一步提取骨髓單個核細(xì)胞的總RNA。產(chǎn)物用20 μL的DEPC水溶解。RNA完整度檢測用電泳法,RNA水平和純度的計算則用紫外分光光度計測量。提取1 μL的總RNA構(gòu)成10 μL反應(yīng)體系,并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以進(jìn)行cDNA合成。將cDNA用于進(jìn)一步常規(guī)PCR擴(kuò)增。條件為:94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,71 ℃ 40 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)SP法結(jié)果判定參考過氧化物酶染色法的評分標(biāo)準(zhǔn)[3]，分別對陽性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度評分。陽性細(xì)胞數(shù)：0分為無陽性細(xì)胞，1分為陽性細(xì)胞數(shù)小于25%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)大于50%；染色強(qiáng)度：0分為無染色，1分為弱染色，2分為中染色，3分為強(qiáng)染色。陽性細(xì)胞數(shù)分值與染色強(qiáng)度分值之和為細(xì)胞得分。0～3分為陰性(-)，>3～<5分為弱陽性(+)，≥5分為強(qiáng)陽性(++)。RT-PCR法結(jié)果判定則通過將PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,同時將100 bp Ladder核酸分子Marker作對照。電泳結(jié)果通過凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行Id1半定量。

2 結(jié) 果

2.1 Id1蛋白在觀察組中表達(dá)水平增高 Id1蛋白在觀察組初治患者的組織切片中表達(dá)水平增高，陽性表達(dá)棕色顆粒見于細(xì)胞質(zhì)。在對照組中，Id1蛋白陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)。觀察組中，40例DLBCL組織切片Id1蛋白陽性表達(dá)率為75.00%(30/40)。對照組中，25例RH組織切片Id1蛋白陽性表達(dá)率為32.00%(8/25)。兩組數(shù)據(jù)相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

A：DLBCL中Id1強(qiáng)陽性表達(dá);B：RH中Id1 弱陽性表達(dá)。

圖1 Id1在兩組中的表達(dá)(SP×400)

2.2 Id1蛋白與觀察組患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)相關(guān)性 根據(jù)觀察組患者初診時的性別、年齡、Ann Arbor-Colswolds臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)高低以及結(jié)外器官受累等臨床指標(biāo)進(jìn)行分組，觀察Id1蛋白與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，觀察組DLBCL組織中的Id1蛋白與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期、LDH高低、結(jié)外器官受累情況等影響患者預(yù)后的指標(biāo)有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表1 Id1蛋白在兩組中的表達(dá)(n)

表2 Id1蛋白在觀察組患者按不同臨床指標(biāo)分組中的表達(dá)情況(n)

2.3 Id1基因在觀察組患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平 Id1在經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增之后，呈186 bp條帶，而作為內(nèi)參照的β-actin則呈91 bp條帶。與對照組相比，Id1基因在觀察組患者的骨髓細(xì)胞中表達(dá)水平明顯增高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，表3。觀察組患者骨髓細(xì)胞中的Id1 mRNA也與患者臨床分期、LDH高低、結(jié)外器官受累情況等指標(biāo)有關(guān)(P<0.05)，見圖2、表4。

M:Marker，50～500 bp；A：Id1基因；B：β-actin基因；1、2、3：DLBCL；4、5、6：RH。

圖2 Id1 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表3 Id1 mRNA在兩組骨髓細(xì)胞中表達(dá)水平

表4 Id1mRNA在觀察組患者按不同臨床指標(biāo)分組中的表達(dá)情況

3 討 論

DLBCL作為最常見的成人侵襲性淋巴系統(tǒng)腫瘤，病因不明，通常對化療反應(yīng)效果佳，與利妥昔單抗聯(lián)合化療完全緩解率高，長期無病生存率為50%～60%[2]，但患者也存在治療后耐藥，甚至出現(xiàn)復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了DLBCL患者的長期生存與預(yù)后。隨著對DLBCL發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)一些異?；蛞约捌涞鞍椎谋磉_(dá)可能與淋巴瘤的發(fā)病有關(guān)，其可影響腫瘤細(xì)胞生長、分化和凋亡[3]。

Id具有一些癌基因的屬性，屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH) 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，包括Id1、Id2、Id3、Id4。Id蛋白與造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的分化有關(guān)，影響造血系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)等正常的發(fā)育成熟。其中，大量研究表明Id1不僅參與細(xì)胞的增殖與分化，還與腫瘤的侵襲力、腫瘤的血管生成以及臨床預(yù)后密切相關(guān)。關(guān)于其與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤相關(guān)性的研究已在國內(nèi)外廣泛展開，但DLBCL中關(guān)于Id1的研究未見報道。為明確Id1在DLBCL患者的臨床意義，通過分析DLBCL組織中分化抑制因子Id1蛋白以及骨髓細(xì)胞中Id1基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明Id1蛋白與Id1基因在DLBCL組織中與骨髓細(xì)胞中表達(dá)水平高于RH。Id1在其他腫瘤中存在過度增高異常表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等[4-5]，這與本研究結(jié)果一致，分析作用機(jī)制與其通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡與分化、影響腫瘤細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤血管新生與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，進(jìn)一步分析預(yù)后相關(guān)因素表明DLBCL患者組織中的Id1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)，與臨床分期、LDH高低、結(jié)外器官受累情況等影響患者預(yù)后的指標(biāo)有關(guān)，對于合并淋巴結(jié)外器官浸潤、臨床分期的增加、LDH的增高DLBCL患者，患者Id1的表達(dá)也相應(yīng)增加，提示Id1對DLBCL的病情預(yù)后判斷可能有價值。有研究發(fā)現(xiàn)Id1與多種腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤范圍、分化程度及臨床分期相關(guān)[7-8]。這將為DLBCL的診斷和治療提供新的思路，為DLBCL抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的可能作用靶點(diǎn)，并為了解Id1特異性和非特異性抑制劑在腫瘤治療的不同階段的效果提供分子基礎(chǔ)。

綜上所述，Id1異常高表達(dá)可能與DLBCL的發(fā)生發(fā)展預(yù)后有關(guān)，ID1可能為DLBCL預(yù)后不良指標(biāo)。但在DLBCL患者中Id1蛋白與其他蛋白互相作用的具體機(jī)制以及調(diào)控Id1 基因表達(dá)的上游因子、下游效應(yīng)子具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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Expression and clinical significance of Id1 and its gene in diffuse large B-cell lymphomas*

RenMingqiang1,YuanZhong1,SuJun2

(1.DepartmentofHematology;2.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)

ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of Id1 in diffuse large B-cell Lymphomas (DLBCL) tissue and Id1 gene in bone warrow cell.MethodsForty cases of DLBCL(observation group) and 25 cases of reactive lymphoid hyperplasia (control group) were included in this study which were admitted by our hospital from October 2011 to October 2014.The expression of Id1 proteins in DLBCL and reactive lymphoid hyperplasia were detected by imunohistochemical technique.The expression of Id1 genes in all patients′ marrow cells was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.The data were collected and analyzed by designed person.ResultsIn 40 DLBCLs,the positive rate of Id1 were 75.00%(30/40),which was higher than in RHs 32.00%(8/25),with statistic difference(P=0.001).Id1 protein was not correlated with sex and age(P>0.05),but was correlated with clinical stage,LDH level and extranodal infiltration(P<0.05).The expression of Id1 genes in marrow cells in DLBCL was higher than in RH (Id1mRNA level 2.80±0.87vs. 1.37±0.51,P<0.05),and also correlated with clinical stage,LDH level and extranodal infiltration(P<0.05).ConclusionThe expression of Id1 proteins and genes are much higher in DLBCL tissue and marrow and probably related to the prognosis of DLBCL.This discovery would contribute to predicting prognosis of DLBCL,which also could be a therapeutic target of DLBCL in the future.

lymphomas，large B-cell，diffuse;lymphoproliferative disorders;inhibitor of differentiation 1

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.003

貴州省科技廳計劃項(xiàng)目[黔科合J字(2009)2175號]。

：任明強(qiáng)(1977-)，碩士，副教授，主要從事惡性血液病研究。

R733.1

A

1671-8348(2015)29-4039-03

2015-04-15

2015-06-16)