艾納香口腔護(hù)理液的處方篩選及其抑菌效果研究

鄒婧，楊全，龐玉新，王凱，范佐旺，李海艷

艾納香口腔護(hù)理液的處方篩選及其抑菌效果研究

鄒婧1，2，3，楊全1，龐玉新2，3，王凱2，3，范佐旺1，2，3，李海艷1，2，3

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南儋州571737；3.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南儋州571737)

目的對艾納香口腔護(hù)理液進(jìn)行處方篩選，并對其抑菌效果及抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行考察，為后期產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。方法以艾納香提取物為原料，以溶液澄清度、口感、除臭效果為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計篩選最優(yōu)處方。對艾納香口腔護(hù)理液進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，并考察在37℃下放置5個月的抑菌穩(wěn)定性。結(jié)果篩選得出的最佳溶劑為體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇，最佳促溶劑為聚氧乙烯氫化蓖麻油。正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的最佳處方為:艾納香提取物∶甘油∶木糖醇∶食用香精的質(zhì)量比為0.03∶5∶0.7∶0.02。采用優(yōu)化處方制備的艾納香口腔護(hù)理液初始抑菌率≥90%，具有較強(qiáng)的抑菌作用；經(jīng)37℃、相對濕度＞75%下放置5個月后，抑菌率仍達(dá)到80%以上。結(jié)論本文所制得的艾納香口腔護(hù)理液澄清透明、口感良好，抑菌作用穩(wěn)定，具有較高的潛在市場應(yīng)用價值。

艾納香提取物；口腔護(hù)理液；溶解度試驗(yàn)；處方篩選；抑菌作用；抑菌穩(wěn)定性

口腔為消化道的第一通道，因直接與外界接觸，是最容易滋生細(xì)菌和微生物的部位。目前，相對于其他口腔護(hù)理產(chǎn)品，口腔護(hù)理液不但具有攜帶方便、清除口腔異味、抑制牙菌斑等多種優(yōu)點(diǎn)，而且還能治療多種口腔疾病及其并發(fā)癥，如因口疾引起的睡眠不良、精神緊張、消化不良等。在各種口腔護(hù)理液中，含精油類的口腔護(hù)理液天然無毒，具有滲透性強(qiáng)、使用后不會出現(xiàn)牙齦變色、菌群失調(diào)、繼發(fā)感染等優(yōu)點(diǎn)，雖含有酒精成分，但對口腔局部無害，市場上使用廣泛?？谇蛔o(hù)理液中的精油主要來源于植物各個部位的提取物，它們具有良好的揮發(fā)性和獨(dú)特的芳香。這類口腔護(hù)理液因抗菌譜廣、毒性低、過敏反應(yīng)少、可以聯(lián)合應(yīng)用，在減少牙菌斑生長過程中，比傳統(tǒng)口腔護(hù)理液更安全、刺激性更小，且因具有天然芳香氣味及良好口感，能提高患者順應(yīng)性，受到越來越多消費(fèi)者的青睞[1-3]。

艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，主要分布于我國海南、貴州、廣西、廣東、云南等省區(qū)。植物艾納香芳香獨(dú)特，以全草或地上部分入藥，在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有悠久的用藥歷史，是一種重要的民間藥物[4-5]。艾納香性溫，味辛、苦，入肝、腎、膀胱經(jīng)，具有溫中活血、調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕、祛痰止咳、治療皮膚燒燙傷、曬后修復(fù)及透皮促滲透等多種功效。艾納香中主要含有揮發(fā)油和黃酮類成分，具有較好的抑菌止癢、抗氧化、鎮(zhèn)痛等藥理活性[6-8]。

結(jié)合上述口腔護(hù)理液在治療口腔疾病、維護(hù)口腔衛(wèi)生的優(yōu)勢以及植物艾納香的多種功效和活性，本研究擬制備一種以艾納香提取物為原料的艾納香口腔護(hù)理液，通過正交試驗(yàn)對其處方進(jìn)行篩選，并通過體外抑菌試驗(yàn)考察其抑菌效果，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；JB-3恒溫定時磁力攪拌器(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司)；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LAB DANCER S25旋渦混合器(德國IKA Lab Dancer)。

1.2 材料

菊科植物艾納香葉的提取物采自貴州省羅甸縣羅蘇鄉(xiāng)，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院龐玉新副研究員鑒定為菊科植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.葉水蒸氣蒸餾法所得的初提物；乙醇(食品級，批號: 150118-85，河南浩宇食品添加劑有限公司)；甘油(批號:40690388-GA，連云港友進(jìn)食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限公司)；聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40，批號:32177616KO，德國BASF SE)；A.SAP(以大豆萃取液作為主成分的天然有機(jī)抗菌劑，批號:110420，福州圣德莉信息技術(shù)有限公司)；木糖醇(食品級，批號:13101606，山東福田藥業(yè)有限公司)；食用香精(食品級，批號:20140926，上海華寶孔雀香精香料有限公司)。

試驗(yàn)菌種為金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC (F)98001]及肺炎克雷伯菌[ATCC13883]，以上菌種均由美國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供并經(jīng)鑒定確定。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方篩選

2.1.1 艾納香提取物溶劑與促溶劑的篩選 因艾納香提取物難溶于水，故選擇一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，并添加表面活性劑作為促溶劑。固定艾納香提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.24%，以溶液澄清透明、無機(jī)械雜質(zhì)為評價指標(biāo)，考察采用15%、30%、40%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇作為溶劑時，Tween 80(吐溫-80)、RH40(聚氧乙烯氫化蓖麻油)及SDS(十二烷基硫酸鈉)3種應(yīng)用較廣的表面活性劑完全溶解艾納香提取物所需的用量，結(jié)果見表1。

由表1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，溶解相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)艾納香提取物所需表面活性劑的用量越?。辉谙嗤掖俭w積分?jǐn)?shù)下，溶解艾納香提取物所需用量最小的表面活性劑是RH40；但乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時，口感刺激性較大，綜合考慮，最終選定以體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇作為溶劑，RH40為促溶劑。

表1 采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作為溶劑時所需表面活性劑的用量Table 1 The comparison of content of surfactants in different concentrations of ethanol

2.1.2 艾納香口腔護(hù)理液的制備方法 將艾納香提取物用表面活性劑RH40及適量15%乙醇混合溶解后，再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的天然抑菌劑A.SAP及保濕劑、甜味劑等其他添加劑按比例充分混合，再用15%乙醇定容至50 mL，靜置、濾過、灌裝，即得。

2.1.3 正交試驗(yàn)篩選處方 在上述溶劑與促溶劑篩選的基礎(chǔ)上，處方中進(jìn)一步添加了保濕劑甘油、矯味劑木糖醇等輔料。本文以口感、澄清度、除臭效果為評價標(biāo)準(zhǔn)(隨機(jī)抽取不同年齡段、不同性別的受試者50例，受試者在清晨未進(jìn)食、進(jìn)水、抽煙，不使用其他口腔護(hù)理產(chǎn)品漱口的情況下，直接使用艾納香口腔護(hù)理液進(jìn)行漱口，用1～5分記分:口感，很好5分，較好4分，一般3分，不好2分，極差1分；澄清度，澄清5分，較澄清4分，一般澄清3分，渾濁2分，非常渾濁1分；除臭效果診斷采用感觀分析法[9]，用鼻進(jìn)行辨析，5分為無氣味，4分為很難聞到氣味，3分為輕微不愉快氣味，2分為中度不愉快氣味，1分為強(qiáng)烈刺鼻氣味)，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)對艾納香提取物、甘油、木糖醇及食用香精的加入量進(jìn)行篩選，因素水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果見表3～表4。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test m/g

由表3～表4可知，各因素的影響大小為A＞C＞B＞D，即艾納香提取物的加入量對處方的影響最大，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其次是木糖醇加入量和甘油加入量，影響最小的是食用香精加入量，此3個因素的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合以上分析，確定艾納香口腔護(hù)理液最佳處方配比為A1B2C3D2，即艾納香提取物∶甘油∶木糖醇∶食用香精的質(zhì)量比為0.03∶5∶0.7∶0.02。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

2.2 抑菌性能及穩(wěn)定性考察

本文選擇金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌4種易引起口腔感染、炎癥及口腔潰瘍的細(xì)菌，分別考察艾納香口腔護(hù)理液對上述4種細(xì)菌的抑菌效果，及在37℃恒溫箱中、保持相對濕度＞75%放置5個月后的抑菌穩(wěn)定性。

2.2.1 組別設(shè)置 以上述處方篩選得到的最佳配比制備的艾納香口腔護(hù)理液作為供試液，對照液為生理鹽水。

2.2.2 菌懸液的制備 分別將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌的24 h斜面培養(yǎng)物用PBS洗下，制成懸液，濁度為1麥?zhǔn)?3× 108cfu/mL)。

2.2.3 菌液稀釋 取上述菌液10 μL，用10 mL容量瓶定容，得到3×105cfu/mL菌液。

2.2.4 抑菌反應(yīng) 分別取上述所得菌液0.1 mL，加至含有5 mL供試液及對照液的試管內(nèi)，作用時間為2 min。分別取上述反應(yīng)時間下的各溶液0.5 mL加入至含5 mL PBS的試管內(nèi)，充分混勻，稱為終止反應(yīng)。分別取終止反應(yīng)下的各溶液與適量PBS混勻，分別稀釋1倍、5倍和10倍。取上述不同比例的稀釋液各0.5 mL，至培養(yǎng)皿內(nèi)，用放涼到40～45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌)或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(真菌)15 mL作傾注，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，(35±2)℃培養(yǎng)24 h(白色念珠菌為48 h)，作活菌菌落計數(shù)。

2.2.5 抑菌穩(wěn)定性 將上述艾納香口腔護(hù)理液在37℃溫箱、相對濕度＞75%條件下，放置5個月，重復(fù)“2.2.4”項(xiàng)試驗(yàn)步驟，測定抑菌率，考察抑菌作用的穩(wěn)定性。根據(jù)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，抑菌率計算方式為:抑菌率＝(對照樣品菌落數(shù)－供試樣品菌落數(shù))/對照樣品菌落數(shù)×100%；評價標(biāo)準(zhǔn)為:產(chǎn)品經(jīng)37℃存放3個月，相對濕度＞75%，抑菌率為50%～90%表明有抑菌作用，抑菌率≥90%表明有較強(qiáng)抑菌作用。

表5分別為初始試驗(yàn)與放置5個月后測得的艾納香口腔護(hù)理液與金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌作用時間為2 min、稀釋倍數(shù)分別為1倍、5倍、10倍下的抑菌率結(jié)果?？梢?，艾納香口腔護(hù)理液對大腸埃希菌及白色念珠菌的作用效果稍強(qiáng)于金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌。另外，該處方下的艾納香口腔護(hù)理液與不同菌種作用2 min，稀釋倍數(shù)分別為1倍、5倍、10倍時，初始測得的抑菌率均≥90%，在溫度37℃、相對濕度＞75%下放置5個月后的抑菌率仍達(dá)到80%以上，表明該艾納香口腔護(hù)理液具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的抑菌作用。

表5 艾納香口腔護(hù)理液抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of bacteriostatic test of Blumea mouthwash

圖1分別為艾納香口腔護(hù)理液及生理鹽水對照組與金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌的作用時間為2 min、稀釋倍數(shù)為10倍時菌落生長情況的對比圖，可見艾納香口腔護(hù)理液抑菌效果明顯。

圖1 艾納香口腔護(hù)理液對4種細(xì)菌的抑菌效果Figure 1 The bacteriostatic effects of Blumea mouthwash on 4 kinds of bacteria

3 討論

口腔護(hù)理液在治療口腔疾病的同時，亦能清除因口疾引起的多種并發(fā)癥，是老人、孩子及伴有牙痛的患者口腔衛(wèi)生保障的首選[10]。本文研究的艾納香口腔護(hù)理液，以芳香獨(dú)特的艾納香提取物為主要原料藥，通過溶劑與促溶劑的篩選試驗(yàn)確定最終選定15%的乙醇作為溶劑，RH40為促溶劑，并配以相應(yīng)的輔料及香精，采用三因素四水平正交試驗(yàn)法，以口感、澄清度及除臭效果作為評價指標(biāo)，對艾納香口腔護(hù)理液處方的用量配比進(jìn)行篩選，由此篩選出的艾納香口腔護(hù)理液澄清透明、無機(jī)械雜質(zhì)，口感良好。研究表明，目前具有廣闊市場前景的口腔護(hù)理液為抗菌型口腔護(hù)理液[11]，本文針對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌4種細(xì)菌對最優(yōu)處方下的艾納香口腔護(hù)理液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)及抑菌穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明由該配方制得的艾納香口腔護(hù)理液具有較強(qiáng)抑菌效果，能有效減少口腔內(nèi)的有害細(xì)菌，放置5個月后的抑菌效果仍達(dá)到80%以上，表明該艾納香口腔護(hù)理液具有較穩(wěn)定的抑菌作用。

綜上所述，本研究的艾納香口腔護(hù)理液澄清透明、無機(jī)械雜質(zhì)，口感良好，具有較強(qiáng)的抑菌效果且抑菌作用穩(wěn)定，能夠很好地控制口腔內(nèi)的致病微生物的數(shù)量，維護(hù)口腔的衛(wèi)生健康，具有較高的市場應(yīng)用和開發(fā)價值。

[1]丁小仙.兩種不同口腔護(hù)理方法的臨床效果比較[J].中國誤診學(xué)雜志，2011，11(2):302.

[2]GUENTHER E.Recent developments in essential oil production[J].Econ Bot，1952，6(4):355-378.

[3]陳宏，丁熙，張秀華，等.比較五種中草藥牙膏對口腔常見菌的抗菌潛力[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19(4): 351-353.

[4]官玲亮，龐玉新，王丹，等.中國民族特色藥材艾納香研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報，2012，13(4):695-698.

[5]龐玉新，王文全，張影波，等.藥用植物艾納香基因組DNA提取方法研究[J].廣西植物，2009，9(6):763-767. [6]王丹，付萬進(jìn)，龐玉新，等.艾納香油過敏性和急毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].熱帶作物學(xué)報，2013，34(12):2499-2502.

[7]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:227.

[8]龐玉新，袁蕾，王中洋，等.艾納香不同部位提取物的抗氧化活性及其對酪氨酸酶的抑制作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(18):4-8.

[9]SHIMURA M，WATANABE S，IWAKURA M，et al. Correlation between measurements using a new halitosis monitor and organoleptic assessment[J].J Periodontol，1997，68(12):182-1185.

[10]周建華，鐘譽(yù).含龍葵活性物質(zhì)漱口水的研制[J].食品科技，2010，35(8):155-160.

[11]柯靜霞.四種抑菌劑在漱口液中的應(yīng)用[J].牙膏工業(yè)，2009，19(2):22-24.

(責(zé)任編輯:陳翔)

Study on the prescription screening and bacteriostatic effects of Blumea mouthwash

ZOU Jing1，2，3，YANG Quan1，PANG Yuxin2，3，WANG Kai2，3，F(xiàn)AN Zuowang1，2，3，LI Haiyan1，2，3
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Danzhou 571737，China；3.Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera，Danzhou 571737，China)

ObjectiveTo study the prescription of the Blumea mouthwash，its bacteriostatic effect and the stability of bacteriostatic action in order to provide theoretical basis for the late product development.MethodsBlumea balsamifera extract was selected as raw material.The optimal formulation of the mouthwash was optimized by orthogonal design，which was evaluated by clarity of solution，taste and deodorization effect as major indexes.The bacteriostatic effects test in vitro and stability of bacteriostatic action placed under the 37℃ after five months later of the mouthwash were studied.Results15%ethanol was selected as the optimal solvent，and RH40 was selected as the optimal surfactant.The optimal formulation was obtained by the orthogonal experiment as follows:Blumea balsamifera extract∶glycerol∶xylitol∶edible flavor＝0.03∶5∶0.7∶0.02.The results of bacteriostatic test showed that bacteriostatic action of Blumea mouthwash was good with an initial bacteriostatic rate above 90%and it was stable after 5 months with abacteriostatic rate still above 80%.ConclusionThe formulated mouthwash is a colorless transparent liquid which has a good taste with stable bacteriostasis，so it is promising to have a high market application value.

Blumea balsamifera extract；mouthwash；solubility experiment；prescription screening；bacteriostatic effects；stability of bacteriostatic

R944.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.003

1006-8783(2015)05-0571-05

2015-07-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81374065)；貴州省黔科合重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2013-6011)

鄒婧(1991—)，女，2013級碩士研究生，Email:zj602395791＠126.com；通信作者:龐玉新(1975—)，男，博士，副研究員，主要從事南藥資源研究與開發(fā)，電話:0898-23300268，Email:blumeachina＠126.com；楊全(1972—)，男，教授，主要從事中藥資源方向的研究，電話:020-39352353，Email:yangquan7208＠vip.163.com。

時間:2015-09-25 14:23

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1423.006.html