桑色素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷機(jī)制的研究

王 杰，馮英凱，張文斌，牟 界，雷文匯

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400011)

論著·基礎(chǔ)研究

桑色素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷機(jī)制的研究

王 杰，馮英凱，張文斌，牟 界，雷文匯

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400011)

目的 觀察桑色素對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)小鼠的作用及機(jī)制研究。方法將30只雄性C57B/L小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及治療組。通過(guò)氣管插管向肺內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg)的方式建立ALI模型，對(duì)照組予等量生理鹽水滴入。治療組于LPS暴露后連續(xù)3 d腹腔注射桑色素40 mg/kg，其余兩組給予等量生理鹽水。72 h后處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液，離心后沉淀行Wright-Giemsa染色計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)，用ELISA法測(cè)定上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β水平；稱質(zhì)量并計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比；HE染色檢測(cè)肺組織病理改變；Western blot法檢測(cè)肺組織Toll樣受體4(TLR4)、IKK和NF-κB表達(dá)水平。結(jié)果氣管內(nèi)滴注LPS成功復(fù)制小鼠ALI模型。模型組小鼠肺組織病理檢查見(jiàn)明顯炎性浸潤(rùn)、肺泡間隔增寬及出血水腫，肺濕干質(zhì)量比、肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及TNF-α，IL-1β水平、肺組織內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)水平和NF-κB、IKK磷酸化水平均較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腹腔注射桑色素可明顯減輕LPS引起的上述病理改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論桑色素能在一定程度上減輕LPS誘導(dǎo)的ALI炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制NF-κB激活有關(guān)。

呼吸窘迫綜合征，成人；NF-κB；桑色素

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的危重病癥，其病死率高達(dá)40%[1]。ALI /ARDS臨床上以呼吸窘迫、非心源性肺水腫及難治性低氧血癥為特點(diǎn)，常繼發(fā)于休克、膿毒血癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷或燒傷、缺血再灌注等損傷。ALI /ARDS的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今仍未完全闡明。多年來(lái)，有關(guān)ALI/ARDS的治療，雖然在糖皮質(zhì)激素、氧自由基清除劑、抗氧化劑、血管擴(kuò)張劑以及肺泡表面活性劑治療等方面作了不少的基礎(chǔ)與臨床研究，但仍然不能有效降低其病死率[2]。目前認(rèn)為，肺內(nèi)失控的炎性反應(yīng)是ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展的根本原因[3]。因此，減輕ALI/ARDS的炎癥對(duì)其預(yù)后有至關(guān)重要的作用。

桑色素(morin)是從黃桑木、桑橙樹(shù)等?？浦参锏臉?shù)皮和多種中草藥中提取出來(lái)的一種黃體酮類色素，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[4]。但關(guān)于桑色素對(duì)ALI的作用及其機(jī)制尚不甚清楚。新近研究證實(shí)桑色素可以降低肺NLRP3蛋白水平，對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型起到保護(hù)作用。本研究擬通過(guò)觀察桑色素對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的ALI小鼠炎癥情況的影響，進(jìn)一步探討桑色素對(duì)ALI炎性反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57B/L小鼠30只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。LPS與桑色素(貨號(hào)M4008)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；SDS-配膠試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸化NF-κB(pNF-κB) p65抗體、NF-κB p65抗體、磷酸化IKK(pIKK)抗體、IKK 抗體和Toll樣受體4(TLR4)抗體均購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司；β-actin兔抗人單克隆抗體、TNF-α及IL-1 ELISA試劑盒均購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 30只雄性C57B/L小鼠分為對(duì)照組、模型組及治療組，每組10只。通過(guò)經(jīng)口氣管插管向模型組及治療組小鼠氣管內(nèi)滴注5 mg/kg LPS(溶于50 L生理鹽水)，對(duì)照組注入等量生理鹽水。隨后小鼠置于垂直位，并旋轉(zhuǎn)1 min以便LPS在肺內(nèi)分散均勻。30 min后，治療組腹腔注射40 mg/kg桑色素，對(duì)照組和模型組接受等量生理鹽水。此后2 d，治療組小鼠每天接受40 mg/kg桑色素腹腔注射。72 h后處死小鼠，收集相關(guān)標(biāo)本。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗與細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組抽取5只小鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠，打開(kāi)胸腔，充分暴露氣管與雙肺。在環(huán)狀軟骨下緣剪一小口，將滅菌腰池引流導(dǎo)管沿切口插入氣管內(nèi)，并用絲線固定。在左肺門處結(jié)扎左主支氣管。將0.5 mL無(wú)菌生理鹽水通過(guò)導(dǎo)管注入右肺內(nèi)，抽吸2次后回收，重復(fù)3次。所得支氣管肺泡灌洗液(BALF)于4 ℃以1 000 r/min離心10 min，吸取上清液分裝后于-80 ℃保存；細(xì)胞沉淀用50 mL滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，吹散，涂片并行Wright-Giemsa染色，行總細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-1β水平 采用ELISA法檢測(cè)BALF離心后上清液中TNF-α、IL-1β水平，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。最后在酶標(biāo)儀450 nmol/L處測(cè)得光密度(OD)值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣本水平。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色及病理評(píng)分 完整分離肺組織并浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后行常規(guī)切片，HE染色后觀察肺組織病理變化。

1.2.5 肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)測(cè)定 各組另5只小鼠麻醉后完整取出左肺，測(cè)量濕質(zhì)量，然后置于80 ℃烤箱中干燥48 h，取出測(cè)量干質(zhì)量，計(jì)算W/D。

1.2.6 Western blot檢測(cè)肺組織中TLR4、IKK 和NF-κB表達(dá)水平 按照凱基蛋白提取試劑盒說(shuō)明書分別提取肺組織蛋白，并以BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別取等量各組蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉(或5% BSA，用于磷酸化抗體)于搖床上封閉1 h，分別加入pNF-κB(1∶500)、NF-κB(1∶500)、pIKK (1∶500)、IKK (1∶500)、TLR4(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)志的山羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，洗膜后用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 ALI模型的建立 對(duì)照組一般情況良好，活動(dòng)自如，呼吸平穩(wěn)，攝食飲水正常。模型組和治療組小鼠在氣道內(nèi)滴入LPS后6 h后出現(xiàn)呼吸急促，鼻唇發(fā)紫，并呈進(jìn)行性加重，并出現(xiàn)懶動(dòng)、攝食減少、對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱。血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，氣道滴入LPS后4 h開(kāi)始，PaO2開(kāi)始下降，至6 h開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 小鼠氣道滴入LPS或生理鹽水6 h后動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果

*：P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.2 肺組織HE染色 對(duì)照組肺組織肺泡間隔均一，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡腔內(nèi)、肺間質(zhì)出血水腫。模型組可見(jiàn)肺泡間隔明顯增厚、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)斑片狀出血，肺泡內(nèi)可見(jiàn)明顯蛋白水腫液和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，治療組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，出血減輕，肺泡內(nèi)水腫液明顯減少，見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C:治療組。

圖1 肺組織病理學(xué)改變(HE×400)

2.3 肺組織W/D測(cè)定 氣道滴入LPS后，模型組小鼠肺組織W/D(11.116±0.743)較對(duì)照組(6.673±0.516)增高；治療組W/D(8.252±0.347)較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4 BALF總細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 氣道滴入LPS后，BALF中細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組；腹腔內(nèi)注射桑色素明顯降低了LPS引起的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)增加程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；△:P<0.05，與模型組比較。

圖2 肺組織W/D測(cè)定

表2 BALF中細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較。

2.5 BALF中TNF-α、IL-1β水平檢測(cè) 氣道滴入LPS后，BALF中TNF-α、IL-1β水平均高于對(duì)照組；腹腔內(nèi)注射桑色素明顯降低了LPS引起的TNF-α、IL-1β水平增加程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 BALF中TNF-α、IL-1β水平檢測(cè)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較。

2.6 肺組織蛋白表達(dá)水平 氣道滴入LPS后，肺組織內(nèi)NF-κB、IKK磷酸化水平和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較對(duì)照組增高，而總NF-κB和總IKK 蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹腔內(nèi)注射桑色素可以顯著抑制LPS引起的NF-κB、IKK磷酸化和TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

1：對(duì)照組；2：模型組；3：治療組。*：P<0.05，與對(duì)照組比較；△：P<0.05，與模型組比較。

圖3 Western blot法檢測(cè)肺組織內(nèi)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

ALI是由多種炎性介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞共同參與，并呈現(xiàn)級(jí)聯(lián)放大的炎性反應(yīng)與繼發(fā)的彌漫性肺損傷。引起ALI/ARDS的病因很多，其中革蘭陰性細(xì)菌感染是最常見(jiàn)的原因之一。LPS由多糖和脂類組成，主要存在于革蘭陰性菌胞壁外膜。LPS誘導(dǎo)的ALI模型是研究ALI病理和發(fā)病機(jī)制的常用模型之一[5-7]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到氣道內(nèi)注入LPS后，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、PaO2進(jìn)行性下降，結(jié)合病理學(xué)檢查觀察到肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，均符合ALI的表現(xiàn)，證明復(fù)制ALI小鼠模型成功。

LPS刺激后，其迅速與LPS結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，并被表達(dá)于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的CD14識(shí)別。LPS-LBP-CD14復(fù)合物通過(guò)Toll樣受體家族，尤其是TLR4途徑激活NF-κB。NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；罨腘F-κB導(dǎo)致多種細(xì)胞因子及趨化因子基因表達(dá)上調(diào)，包括TNF-α和IL-1β[8]。研究表明，在ALI/ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中，TNF-α和IL-1β的水平明顯增高。TNF-α和IL-1β不僅可以放大炎癥效應(yīng)、引起炎癥損傷，還可招募更多的中性粒細(xì)胞至肺內(nèi)、增加髓過(guò)氧化物酶活性而加劇肺組織的損傷[11]。并且，經(jīng)NF-κB調(diào)控生成的炎癥產(chǎn)物，亦能進(jìn)一步活化NF-κB，形成一個(gè)使炎癥無(wú)限放大和延續(xù)的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，更進(jìn)一步加重肺損傷。由此可見(jiàn)，內(nèi)毒素激活NF-κB，從而誘導(dǎo)促炎因子的大量生成，是ALI/ARDS肺內(nèi)失控炎癥的始動(dòng)和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到LPS刺激后，TLR4蛋白表達(dá)水平增高，支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量、TNF-α和IL-1β水平顯著增加，說(shuō)明LPS促進(jìn)了TLR4上調(diào)，并在小鼠肺內(nèi)誘發(fā)了明顯的炎性反應(yīng)。而桑色素有效抑制了LPS引起的TLR4過(guò)表達(dá)，下調(diào)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低了TNF-α和IL-1β水平，一定程度上抑制了ALI失控的炎性反應(yīng)。

而NF-κB的激活與IKK(IB kinase)復(fù)合物密切相關(guān)[12-13]。IKK由催化亞基(IKK、IKK)和調(diào)節(jié)亞基(IKK)組成，是IB的上游信號(hào)。在正常情況下，NF-κB p50/NF-κB p65形成二聚體并與IB結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，IKK和IKK迅速磷酸化使IKK激活，促進(jìn)IB磷酸化。緊接著磷酸化的IB在泛素化酶復(fù)合體的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解，導(dǎo)致NF-κB p50/NF-κB p65二聚體磷酸化并轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。在以往的研究中，王瑩等[14]發(fā)現(xiàn)桑色素可以促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，此作用可能與抑制NF-κB、減輕炎性反應(yīng)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS顯著增加了IKK和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平；而桑色素可有效抑制LPS誘導(dǎo)的IKK和NF-κB p65過(guò)度磷酸化。因此，筆者推測(cè)，桑色素對(duì)ALI的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制NF-κB的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

桑色素作為一種天然黃體酮類色素，在自然界分布廣泛。前期研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[4,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，用桑色素治療LPS誘導(dǎo)的ALI，可顯著抑制LPS引起的肺組織IKK和NF-κB p65蛋白磷酸化表達(dá)，降低支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)量和TNF-α、IL-1β水平，減少肺組織含水量，改善肺組織病理學(xué)損傷。結(jié)果提示，在ALI時(shí)，桑色素可能通過(guò)抑制肺內(nèi)NF-κB激活，從而減輕NF-κB激活相關(guān)的炎性反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)肺組織的作用。

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Effect of morin on LPS induced acute lung injury and its mechanism

WangJie，F(xiàn)engYingkai,ZhangWenbin,MouJie,LeiWenhui

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TraditionalChineseMedicineHospitalofChongqing,Chongqing400011,China)

Objective To study the effect of morin on LPS induced acute lung injury mouse model and its mechanism.Methods Thirty male C57B/L mice were randomly divided into control group,LPS group and LPS+morin group,with 10 in each group.5 mg/kg LPS was instilled into the lung from an trachea intubation in LPS group and LPS+morin group.Then the mice in LPS+morin group received an intraperitoneal injection of morin (40 mg/kg) every day for the next 3 d.Others received an equal amount of saline.After 72 h,the mice were sacrificed.The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected and centrifuged;the sediments were stained with Wright-Giemsa for total cell and neutrophil count and the supernates were prepared for ELISA.The wet and dry weight of lung was weighed to calculate the wet/dry weight ratio.HE staining was performed to examine the pathological change of lung.Western blot was used to determined the expression of TLR4,IKK and NF-κB.Results Intratracheal instillation of LPS successfully established ALI model in mouse.LPS caused significant pathological changes including inflammatory cells infiltration,alveolar septa thickness,hemorrhage and edema.The wet/dry weight ratio,the total cell count,neutrophil count,TNF and IL-1β level in BALF,and the expression of TLR4,NF-κB,and IKK were all increased significantly (P<0.05),which were alleviated by intraperitoneal injection of morin.Conclusion Morin can dampen the inflammatory response during LPS induced ALI in mouse,which is potentially attributed to its inhibitory effect on the activation of NF-κB.

respiratory distress syndrome,adult;NF-kappa B;morin

王杰(1977-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.006

R563

A

1671-8348(2015)19-2609-04

2014-11-08

2015-01-26)