參麥對(duì)大鼠急性心肌缺血血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

陳紅英 李賢玉 王文杰 彭吉霞

(1 十堰市太和醫(yī)院(附屬湖北醫(yī)藥學(xué)院)骨2科，湖北，442000； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北，442000)

參麥對(duì)大鼠急性心肌缺血血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

陳紅英1李賢玉2王文杰1彭吉霞2

(1 十堰市太和醫(yī)院(附屬湖北醫(yī)藥學(xué)院)骨2科，湖北，442000； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北，442000)

目的：觀察參麥對(duì)大鼠急性心肌缺血血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法：大鼠40只，采用結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支30 min后松解扎扣再灌注60 min，反復(fù)3次以造成心肌缺血再灌注損傷模型，并隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、美托洛爾組及參麥小大劑量組。五組大鼠均經(jīng)腹腔注射給藥，于治療前及30 d后分別采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)HIF-la表達(dá)情況、受體胎肝激酶1(FLK-1)，籍此考察參麥對(duì)大鼠急性心肌缺血血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響。結(jié)果：參麥明顯增高VEGF蛋白質(zhì)及mRNA、HIF-1a、FLK-1的表達(dá)，縮小心肌缺血面積，與模型組比較(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，參麥小、大劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：參麥可減輕大鼠急性心肌缺血缺氧性損傷和血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)程度，其作用機(jī)制可能是其促進(jìn)大鼠缺血心肌血管內(nèi)皮再生有關(guān)，對(duì)改善再灌注損傷血管內(nèi)皮功能紊亂有一定的防治作用。

大鼠急性心肌缺血；參麥；血管內(nèi)皮生長因子；缺氧誘導(dǎo)因子-1；受體胎肝激酶-1

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growthfactor，VEGF)具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成再生等作用[1]。VEGF對(duì)急性缺血區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立及改善缺血心肌血流量具有特異性，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性心肌梗死有明顯療效[2]。在心肌梗死、冠脈搭橋術(shù)、再通術(shù)等疾病及手術(shù)時(shí)常伴隨心肌缺血再灌注損傷[3]，參麥常用于治療此類疾病，由于其對(duì)大鼠缺血心肌血管內(nèi)皮再生的影響及其機(jī)制鮮有臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，系統(tǒng)觀察了其對(duì)心肌血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。選取40只健康大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、美托洛爾組及參麥小、大劑量組。

1.2 儀器及藥品 參麥注射液(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mL/支，國藥準(zhǔn)字Z330220021，批號(hào)：010873)；VEGF、FLK-1試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；HIF-I(北京博奧生生物技術(shù)公司)；提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)。

1.3 大鼠心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?參照文獻(xiàn)[4]，所有動(dòng)物在造模前夜停止喂食，不禁水，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)方法將已分組的大鼠麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，接Ⅱ?qū)?lián)心電圖及小動(dòng)物呼吸機(jī)，于胸骨左緣第4～5肋間隙開胸暴露心臟，術(shù)中保持胸膜完整，以絲線距心臟根部0.2 cm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min后松解扎扣復(fù)灌60 min，反復(fù)3次后抽出絲線關(guān)閉胸腔，所有動(dòng)物以結(jié)扎后局部心肌顏色變淺，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高并(或)出現(xiàn)心律失常為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組僅開胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支造模。對(duì)照組及模型組術(shù)后腹腔注射0.9%氯化鈉注射液4 mL/(kg·d)(按此劑量連續(xù)給藥2周)。陽性藥美托洛爾組(50 mg/(kg·d))腹腔注射，參麥大劑量組再灌注腹腔注射參麥4 mL/(kg·d)、參麥小劑量組2 mL/(kg·d)[按成人體表面積換算：大鼠(200 g)/人(70 kg)=0.018/1；按此劑量連續(xù)治療30 d]。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[5]，取對(duì)照組及模型組大鼠各8只斷頭處死取心，取出心肌組織在液氮中暫存后轉(zhuǎn)移至-70 ℃低溫冰箱保存，以備VEGF蛋白分析。取出心肌組織冰水浴下機(jī)械勻漿1 500 r/min離心后心肌組織液，30 d后同上步驟分別斷頭處死美托洛爾組及參麥大小劑量組取心研磨2 000 r/min離心后心肌組織液，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌VEGF、VEGFmRNA、HIF-la、HIF-lamRNA、FLK-1表達(dá)。

1.5 組織學(xué)檢查及心肌梗死范圍 模型組及參麥2組大鼠于治療30 d后斷頭處死，迅速取心后濾紙吸干稱重，20 ℃冰凍30 min，冠狀面均勻切成2 mm組織切片，37 ℃的1%TTC避光染色30 min后用4%多聚甲醛固定。由于梗死區(qū)著色加深，精確剝離梗死部位，精密電子天平精確稱量并記錄重量，計(jì)算梗死范圍[梗死率(%)=(梗死部位質(zhì)量/腦總質(zhì)量)×100%]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用Dunnett檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。

2 結(jié)果

2.1 參麥注射液對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌組織學(xué)形態(tài)學(xué)及梗死范圍的影響 在治療30 d后，對(duì)照組心肌組織病理圖片顯示著色均勻，平滑肌排列整齊，無壞死溶解現(xiàn)象；模型組梗死區(qū)著色加深，其平滑肌細(xì)胞排列紊亂且有部分溶合，缺血區(qū)出現(xiàn)大量壞死灶；參麥大小兩劑量組組織形態(tài)學(xué)觀察類似，梗死區(qū)著色加深，但比模型組淺，梗死區(qū)域明顯減少，僅見少量壞死灶，梗死區(qū)僅有少量平滑肌細(xì)胞溶合，平滑肌細(xì)胞排列紊亂但明顯好于模型組，參麥大小兩劑量組梗死范圍為(11.02±0.23，10.04±0.31)明顯低于模型組，與模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示參麥具有擴(kuò)張微動(dòng)脈減少心肌梗死范圍的作用。見表1。

2.2 參麥注射液對(duì)大鼠心肌VEGF、VEGFmRNA表達(dá)的影響 如表2，模型組在30 d后VEGF、VEGFmRNA表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺血、缺氧是促進(jìn)VEGF分泌的最主要因素，此時(shí)心肌損傷嚴(yán)重。美托洛爾組大鼠心肌VEGF、VEGFmRNA明顯增高，與對(duì)照組及模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參麥大小劑量組均呈升高趨勢(shì)，與對(duì)照組及模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但大小劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明參麥注射液有與美托洛爾類似的提高VEGF、VEGFmRNA的作用。

2.3 參麥注射液對(duì)大鼠HIF-la、HIF-lamRNA表達(dá)的影響 見表2，參麥大小劑量組HIF-la、HIF-lamRNA均有上升，與對(duì)照組及模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但大小劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明參麥注射液有與美托洛爾類似的提高HIF-la、HIF-lamRNA的作用。

2.4 參麥注射液對(duì)大鼠FLK-1、FLK-1mRNA表達(dá)的影響 參麥大小劑量組均有上升，與對(duì)照組及模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但大小劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 大鼠心肌缺血梗死范圍

注：與模型組比較，bP<0.05。

表2 參麥注射液對(duì)心肌梗死大鼠血管內(nèi)皮VEGF各指標(biāo)的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05; 與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

近年來心肌缺血再灌注損傷的防治已取得了明確的成果，大量中草藥被應(yīng)用到臨床防治缺血再灌注損傷，其中參麥注射液在臨床上大量應(yīng)用并取得可靠療效，其主要有效成分為人參皂苷、麥冬皂苷等[7-8]。通過調(diào)節(jié)血小板源生長因子(PDGF)、顯著增加Bcl-2基因表達(dá)、減少c-fos基因的表達(dá)及細(xì)胞凋亡數(shù)，增加VEGF以促進(jìn)血管內(nèi)皮增生重建等[9-10]?，F(xiàn)已廣反泛應(yīng)用于臨床治療心腦血管栓塞及缺血再灌注類疾病并取得了良好的療效。

正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動(dòng)態(tài)平衡，血管內(nèi)皮保持其完整性，但當(dāng)缺血再灌注損傷時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，且機(jī)體清除氧自由基能力下降，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損嚴(yán)重[11]。美托洛爾具有促進(jìn)VEGF分泌及缺血心肌血管新生，減慢心率、抑制心肌收縮力、降低心肌耗氧量等作用，常用于治療冠心病[12]，故在本研究中作為陽性藥對(duì)比。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，王駿等[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)VEGF參與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)，VEGF的高低常作為血管內(nèi)皮功能及冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)建立情況的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠在造成心肌缺血再灌注損傷后心肌VEGF、VEGFmRNA、HIF-la、HIF-lamRNA、FLK-1表達(dá)均有不同程度升高，血管內(nèi)皮嚴(yán)重受損，提示缺血、缺氧是促進(jìn)VEGF分泌的最主要因素。在應(yīng)用參麥注射液后，參麥注射液大小劑量組心肌VEGF、VEGFmRNA、HIF-la、HIF-lamRNA、FLK-1表達(dá)均有不同程度的升高，說明參麥注射液具有促進(jìn)VEGF的分秘、誘導(dǎo)缺血心肌的血管再生，促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[14]。這可能與參麥注射液促進(jìn)Ca2+-ATP酶活性恢復(fù)，增強(qiáng)鈉鉀ATP酶活力，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并通過鈉鉀ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換來抑制鈉鈣交換，阻止Ca2+內(nèi)流，改善心肌組織能量代謝[15]，活血化瘀，改善微循環(huán)，增加冠脈灌注和心肌供氧，進(jìn)而改善心肌缺血而起到保護(hù)作用有關(guān)。由于參麥注射液具有改善心肌組織的能量代謝，改善病灶缺血、水腫，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)，減輕缺血再灌注后組織損傷，這與刁玉晶[16]增加血供，擴(kuò)張微動(dòng)脈進(jìn)而減少了其梗死面積而對(duì)組織起到保護(hù)作用相一致。

缺血再灌注后的臨床癥狀和預(yù)后有賴于心臟冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)重建，因此，積極尋找具有促進(jìn)缺血心肌血管新生的臨床常用藥物對(duì)缺血性心臟病治療具有實(shí)用價(jià)值。側(cè)支循環(huán)的形成和開放能夠減輕心肌缺血，防止心肌細(xì)胞壞死，預(yù)防和延緩缺血性心肌病的形成，改善患者的癥狀。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)參麥注具有增加血管內(nèi)皮VEGF分秘的作用，但缺血再灌注損傷機(jī)制是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，參麥注射液如何在各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)和干預(yù)并阻斷其發(fā)生，還有待于深入研究。

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(2014-10-13收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

《世界中醫(yī)藥雜志》英文刊獲國際影響力提升計(jì)劃項(xiàng)目資助

2015年6月11日，中國科協(xié)等部門聯(lián)合組織的中國科技期刊國際影響力提升計(jì)劃2015年D類項(xiàng)目評(píng)審結(jié)果出爐，由世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)主辦、《世界中醫(yī)藥》雜志社出版的《世界中醫(yī)藥雜志》英文刊(World Journal of Traditional Chinese Medicine, WJTCM)獲得該項(xiàng)目資助。

為促進(jìn)我國科技期刊國際化發(fā)展，提升英文科技期刊國際影響力與核心競爭能力，中國科協(xié)、教育部、國家新聞出版廣電總局、中國科學(xué)院、中國工程院等部門共同實(shí)施中國科技期刊國際影響力提升計(jì)劃。該計(jì)劃D類項(xiàng)目的目標(biāo)是創(chuàng)辦一批代表我國前沿學(xué)科、優(yōu)勢(shì)學(xué)科，或能填補(bǔ)國內(nèi)英文科技期刊學(xué)科空白的高水平英文科技期刊，引導(dǎo)期刊大幅度提升期刊學(xué)術(shù)引證指標(biāo)，建立科學(xué)規(guī)范的編輯出版運(yùn)行機(jī)制，提升管理效能，盡快進(jìn)入SCI等國際知名檢索系統(tǒng)，成為國際化科技期刊。

《世界中醫(yī)藥雜志》英文刊(ISSN 2311-8571，季刊)由世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WFCMS)主辦，是WFCMS、中醫(yī)藥規(guī)范化研究學(xué)會(huì)GP-TCM的官方雜志。本刊采用國際標(biāo)準(zhǔn)化辦刊工作流程及ScholarOne投審稿系統(tǒng)，以國際化的編委專家團(tuán)隊(duì)和中醫(yī)藥學(xué)科領(lǐng)域前沿學(xué)者作者群為支撐，經(jīng)過嚴(yán)格的編審，刊登高質(zhì)量的中醫(yī)學(xué)術(shù)論文，全部論文在官方網(wǎng)站(www.wjtcm.org)優(yōu)先出版，以供免費(fèi)閱讀和下載。內(nèi)容涵蓋中醫(yī)藥四個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域，聚焦于中醫(yī)藥具有代表性的研究方向，以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)語言對(duì)中醫(yī)藥學(xué)進(jìn)行闡釋，特色明確，收文范圍明晰，旨在向全世界的醫(yī)生和生物醫(yī)藥研究者介紹中醫(yī)、中藥、針灸的臨床療效、作用機(jī)理，為解決復(fù)雜性疾病和疑難病癥提供新的思路、方法和措施。

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Effect of Shenmai on the Expressions of Myocardial Vascular Endothelial Growth Factors in Rats with Acute Myocardial Ischemia

Chen Hongying1， Li Xianyu2,Wang Wenjie1, Peng Jixia2

(1TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine; 2MechanismLaboratory,HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000,China)

Objective:To observe the effect of Shenmai on expressions of myocardial vascular endothelial growth factors in rats with acute myocardial ischemia, and explore its mechanism. Methods: 40 rats received ligation of left anterior descending coronary artery. 30 minutes later, release buckles reperfusion for 60 min to cause myocardial ischemia reperfusion injury model. The rats were then randomly divided into control group, model group, positive drug metoprolol group and Shenmai small dose, and Shenmai large dose group. Five groups of rats were treated with intraperitoneal injection, before treatment and 30 days respectively by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical detection of myocardial VEGF and hypoxia inducible factor -1a (HIF-1a) HIF-la expression, receptor in fetal liver kinase 1 (FLK-1), the study of acute effect of nationality myocardial ischemic myocardium in rats of vascular endothelial growth factor expression. Results: Shenmai injection significantly increased the expression of VEGF protein and mRNA, HIF-1a, FLK-1, reduce the myocardial ischemic area, compared with the model group (P<0.05), the difference was statistically significant, no significant difference in small, large dose Shenmai group. Conclusion: Shenmai injection can reduce the rat model of acute myocardial ischemia and hypoxia injury and vascular endothelial inflammatory reaction. Its mechanism may be related to the vascular endothelial regeneration in rats with myocardial ischemia reperfusion injury. It helps to improve the prevention of vascular endothelial dysfunction.

Acute myocardial ischemia of rats; Shenmai injection; Vascular endothelial growth factor; Hypoxia inducible factor-1 receptor in fetal liver kinase-1

彭吉霞(1972.7—)，女，本科，副教授，研究方向:病理生理及臨床藥理學(xué)研究，E-mail：951777718@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.025