真武湯對(duì)糖尿病腎病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及尿蛋白排泄率的影響

曾偉平 徐孝容 柳 清

(四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，簡(jiǎn)陽(yáng)，641400)

真武湯對(duì)糖尿病腎病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及尿蛋白排泄率的影響

曾偉平 徐孝容 柳 清

(四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，簡(jiǎn)陽(yáng)，641400)

目的：分析真武湯對(duì)糖尿病腎病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及尿蛋白排泄率的影響。方法：將本院收治的70例2型糖尿病腎病患者根據(jù)入院順序隨機(jī)分為對(duì)照組(35例)和治療組(35例)，2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，內(nèi)科口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療(劑量依照患者血糖水平而設(shè)定)；合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片，10～20 mg，2次/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀，20 mg/d。治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上運(yùn)用真武湯,2組均以8周為1個(gè)療程，比較2組治療前后蛋白尿排泄率(uAER)及VEGF蛋白和mRNA的變化。結(jié)果：1)2組經(jīng)過(guò)治療uAER均較治療前改善，其中治療組改善的幅度更為明顯(P<0.05)，說(shuō)明真武湯可明顯改善糖尿病腎病患者的uAER，在一定程度上抑制了糖尿病腎病病情的進(jìn)展。2)經(jīng)過(guò)治療2組的VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均有所下降，其中治療組下降的趨勢(shì)較對(duì)照組明顯(P<0.05)，說(shuō)明聯(lián)合使用中藥方可以使VEGF在蛋白和基因?qū)用嫔暇盏揭种啤?)uAER與VEGF水平呈非正態(tài)分布，使用Spearman法進(jìn)行相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)uAER與VEGF的表達(dá)存在正相關(guān)性。結(jié)論：真武湯可降低糖尿病腎病患者血清VEGF水平，同時(shí)降低uAER，是其保護(hù)腎功能的可能作用機(jī)制之一。

糖尿病腎?。荒虻鞍着判孤?；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；真武湯

隨著現(xiàn)代生活飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，糖尿病的發(fā)病率逐年上調(diào)，隨之導(dǎo)致糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DKD)的發(fā)病率亦上升，具最新調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)據(jù)最新統(tǒng)計(jì)[1]，我國(guó)目前約有5 000萬(wàn)人正面臨著糖尿病的威脅。DKD的發(fā)生是一個(gè)緩慢的漸進(jìn)過(guò)程，腎功能的早期損害存在可逆性，故探尋可敏感評(píng)估DKD早期病變的生物學(xué)指標(biāo)勢(shì)在必行。隨著現(xiàn)代醫(yī)療手段的逐步提升，我們發(fā)現(xiàn)腎臟血管增生病變與DKD的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，一項(xiàng)多中心大樣本[2]關(guān)于尿毒癥病因譜調(diào)查顯示，糖尿病是導(dǎo)致尿毒癥發(fā)生的主要原因之一，僅次于慢性腎炎。因此我們有理由相信科學(xué)合理的治療糖尿病可部分逆轉(zhuǎn)腎損害。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascuoar Endothelial Growth Factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，是影響微循環(huán)系統(tǒng)功能主要因子之一。Doi K[3]發(fā)現(xiàn)注射VEGF抑制劑可促進(jìn)糖尿病模型大鼠糖尿病癥狀。彭小靜[4]等通過(guò)降低大鼠血漿中VEGF的水平實(shí)現(xiàn)了加速大鼠創(chuàng)面修復(fù)的目的。

中醫(yī)古籍無(wú)對(duì)DKD進(jìn)行記載，多歸結(jié)于“消渴”“水腫”“脹滿(mǎn)”“關(guān)格”等范疇，臟氣虛衰、瘀血阻滯、水濕內(nèi)停是其主要病機(jī)。由于各類(lèi)西藥都可能產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，糖尿病腎病患者較難耐受。所以，探尋更安全有效的糖尿病腎病癥治療方案尤其重要，中藥湯藥的治療價(jià)值逐漸受到重視。《真武湯》源自《傷寒論》，屬于溫陽(yáng)利水經(jīng)典方，近千年的臨床驗(yàn)證，證實(shí)該方在內(nèi)外婦女各科均有理想療效。本研究將70例糖尿病腎病患者納入研究，利用真武湯為主方，根據(jù)患者不同伴隨癥狀進(jìn)行加味，具體如下：

1 臨床治療及方法

1.1 一般資料 將本院2009年1月至2013年1月70例糖尿病腎病患者納入本研究，其中男性41例，女性29例，年齡32～61歲，平均(44±5)歲，病程3～19年，平均(9±2)年。并發(fā)癥：肥胖13例，高血壓15例，高脂血癥9例。所有患者符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)頒布的《中醫(yī)內(nèi)科常見(jiàn)病診療指南》中關(guān)于糖尿病腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；2)尿蛋白排泄率20～200 μg/min；3)簽署知情同意書(shū)。2組患者根據(jù)數(shù)字隨機(jī)法分為對(duì)照組及治療組，2組患者的年齡、性別、基礎(chǔ)疾病構(gòu)成、病程等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。具有均衡性和可比性。本研究方案經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)嚴(yán)重肝臟、腎臟、或心功能異常者；2)近3個(gè)月內(nèi)有血管活化劑、抗血小板藥物使用史；3)惡性腫瘤及重癥感染患者；4)糖尿病急性代謝性并發(fā)癥者；5)妊娠期、哺乳期婦女；6)精神異常/認(rèn)知功能障礙患者；7)不予簽署知情同意書(shū)患者。

1.3 治療方法 2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，內(nèi)科口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療(劑量依照患者血糖水平而設(shè)定)；合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片(國(guó)藥準(zhǔn)：H32026198)，10～20 mg，2次/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀(京必舒新批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20000009)，20 mg/d。治療組在上述治療方案基礎(chǔ)上加用真武湯，具體方藥如下：制附子20 g(先煎)，白術(shù)10 g，茯苓20 g，澤瀉15 g，生姜12 g，白芍10 g，豬苓15 g，玉米須10 g，丹參20 g，黃芪20 g，大黃12 g。頭暈嚴(yán)重者加天麻9 g，鉤藤9 g；四肢冰冷明顯者加肉桂9 g；四肢麻痹明顯者加桑枝9 g，地龍12 g；嘔吐者加用半夏6 g、藿香9 g。2組均以8周為1個(gè)療程。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 蛋白尿排泄率 留取患者24 h尿液，加入Dimethylbenzene(二甲苯)進(jìn)行防腐，采用放射免疫法對(duì)尿蛋白Alb進(jìn)行測(cè)定，然后根據(jù)尿液的容積和所得Alb數(shù)值計(jì)算出蛋白尿排泄率(uAER)。

1.4.2 VEGF蛋白濃度檢測(cè) 研究對(duì)象空腹，無(wú)菌情況下用無(wú)肝素真空采血管采集肘靜脈血5 mL，1 h內(nèi)，用3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，使用高壓槍頭吸取離心后的上清液，送至醫(yī)院檢驗(yàn)中心，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(日立7180型)檢測(cè)VEGF濃度。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，包被、封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔、洗滌、加入待檢測(cè)樣品、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液、終止反應(yīng)等過(guò)程均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，OPD顯色后采用492 nm波長(zhǎng),TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)需要450 nm波長(zhǎng)。檢測(cè)時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零。用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均值的比值(P/N)表示。操作過(guò)程全部按照IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 VEGF mRNA水平檢測(cè) 取不同組別患者治療前及治10周后前臂外周抗凝血5 mL，加入適量淋巴細(xì)胞分離液。隨后取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液充分混勻，使用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)每107數(shù)量的細(xì)胞加入1 mL Trizol的比例進(jìn)行裂解，震蕩30 s；加0.2 mL氯仿，12 000 g，4 ℃離心，15 min；輕輕吸取上層無(wú)色水相至0.5 mL EP管中；加等體積異丙醇后4 ℃離心，12 000 g，10 min；在管底部可見(jiàn)微量RNA沉淀。加入75%乙醇1 mL，棄上清，干燥后用DEPC水溶解RNA，根據(jù)所RNA濃度，計(jì)算RNA體積。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及相關(guān)引物說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的試劑進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，VEGF引物序列：F ATTGAGACCCTGGTGGAC，R CCTATGTGCTGGCTTTGG；β-actin引物序列：F TGACAGGATGCAGAAGGAGA，R GCTGGAAGGTGGACAGTGAG。取PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像。BIO-LAB圖像軟件分析電泳條帶。

2 結(jié)果

2.1 2組uAER比較 2組經(jīng)過(guò)治療uAER均較治療前改善，其中治療組改善的幅度更為明顯(P<0.05)，說(shuō)明真武湯可明顯改善糖尿病腎病患者的uAER，在一定程度上抑制了糖尿病腎病病情的進(jìn)展。具體見(jiàn)表1。

表1 2組uAER療效比較

注：與治療前相比*P<0.05，與對(duì)照組相比,△P<0.05。

2.2 2組VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)變化 經(jīng)過(guò)治療2組的VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均有所下降，其中治療組下降的趨勢(shì)較對(duì)照組明顯(P<0.05)，說(shuō)明聯(lián)合使用真武湯可以使VEGF在蛋白和基因?qū)用嫔暇艿揭种?。具體見(jiàn)表2、圖1和圖2。

表2 2組VEGF蛋白變化比較

注：與治療前相比*P<0.05，與對(duì)照組相比,△P<0.05。

2.3 uAER與VEGF之間的相關(guān)性分析 uAER與VEGF水平呈非正態(tài)分布，使用Spearman法進(jìn)行相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)uAER與VEGF的表達(dá)存在正相關(guān)性，具體見(jiàn)表3。

圖1 2組治療前后VEGF mRNA的比較

圖2 2組VEGF與內(nèi)參的mRNA灰度比較的比較

表3 相關(guān)性分析

3 討論

糖尿病繼發(fā)的腎損傷屬于進(jìn)展性疾病，糖尿病早期腎體積增大，腎小球?yàn)V過(guò)率增加，呈高濾過(guò)狀態(tài)，以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長(zhǎng)出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球?yàn)V過(guò)率降低，進(jìn)而發(fā)展為腎功能不全、尿毒癥，一旦進(jìn)入終末期腎病5年存活率僅為27%[6]。有資料顯示2型糖尿病導(dǎo)致的腎功能損傷在一定程度上具有可逆性，認(rèn)為在DKD疾病早期進(jìn)行干預(yù)尤為重要，因此本研究納入患者尿蛋白排泄率20～200 μg/min，即對(duì)早期DKD進(jìn)行觀察并干預(yù)。

VEGF是一種小分子蛋白質(zhì)，在正常的生理狀態(tài)下，VEGF在血漿呈低表達(dá)，以低量的表達(dá)維持血管的完整性，它通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸激酶受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[6-9]。在病理狀態(tài)下，局部組織缺血缺氧使微血管發(fā)生病變，VEGF過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)血管的通透性，導(dǎo)致尿蛋白的滲漏，從而導(dǎo)致腎功能的進(jìn)一步破壞。VEGF在腎損傷臨床患者及動(dòng)物模型具有高表達(dá)均已得到證實(shí)[10-15]，因此降低DKD患者VEGF的表達(dá)量應(yīng)該可以達(dá)到改善腎功能的目的。本研究對(duì)照組患者接受內(nèi)科常規(guī)治療，患者治療后的uAER得到一定程度的改善，且同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組患者外周血漿中VEGF表達(dá)量得到下調(diào)，因此對(duì)照組患者腎功能改善的可能原因應(yīng)該是通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)。由于各類(lèi)西藥都可能產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，糖尿病腎病患者較難耐受，因此本研究對(duì)根據(jù)DKD中醫(yī)病機(jī)自擬中藥方對(duì)35例治療組患者進(jìn)行治療，我們發(fā)現(xiàn)不論是在降低uAER還是下調(diào)VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)輔助中藥的患者改善均較對(duì)照組明顯，我們認(rèn)為真武湯原方雖僅有5味藥，方中以附子大辛大熱，溫壯腎中陽(yáng)氣，以散在里之寒水為主藥；輔以生姜溫散水氣，茯苓、白術(shù)健脾利水，以抵抗DKD中水濕內(nèi)停的病機(jī)而發(fā)揮療效；白芍?jǐn)筷幒屠?，并制熟附子、生姜之辛燥，使利水而不傷陰。我們還發(fā)現(xiàn)古今諸多文獻(xiàn)對(duì)于白芍一味在不同疾病的使用有諸多不同論述，“水濕內(nèi)停”是其使用的關(guān)鍵點(diǎn)，水濕難化內(nèi)停是DKD重要病機(jī)之一，故本研究使用白芍發(fā)揮輔助疏泄肝氣、開(kāi)水液下行之路的作用。方中我們加味黃芪，黃芪性味甘溫，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒的功效，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用；丹參活血化瘀，現(xiàn)代藥理證實(shí)具有擴(kuò)張腎血管、改善腎臟局部血流、抗血栓的作用，從而達(dá)到腎保護(hù)的目的；大黃增強(qiáng)本方化濁解毒的功效，減少代產(chǎn)物對(duì)腎功能的毒害，藥理研究發(fā)現(xiàn)大黃提取物可減少單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善腎臟組織間質(zhì)的炎癥。全方共奏溫補(bǔ)脾腎，助陽(yáng)利水之功效。

我們還對(duì)uAER與VEGF的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)二者存在正相關(guān)關(guān)系，于是我們有理由相信將uAER與VEGF聯(lián)合評(píng)估DKD是可行。總之，DKD的發(fā)生與VEGF濃度變化具有密切關(guān)系，而真武湯可以通過(guò)降低VEGF濃度達(dá)到逆轉(zhuǎn)DKD的發(fā)展。但由于本研究隨訪時(shí)間較短、樣本量較少，以期在下階段增大樣本量、延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步證實(shí)真武湯改善DKD預(yù)后的明確機(jī)制，以指導(dǎo)臨床用藥。

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(2014-12-08收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

The Effects of Spleen-Yang Strengthening Decoction on Vascular Endothelial Growth Factor and Urinary Protein Excretion Rate in Patients With Diabetic Nephropathy

Zeng Weiping,Xu Xiaorong,Liu Qing

(JianyangCityHospitalofTraditionalChineseMedicine，Jianyang641400，China)

Objective:To analyze the impact of Spleen-yang Strengthening Decoction on vascular endothelial growth factor and urinary protein excretion rate in patients with diabetic nephropathy.Methods:Seventy cases of patients with Type 2 Diabetic nephropathy who were received and treated in our hospital were randomly divided into the control group (35 cases) and the observation group (35 cases) according to admission order, both of the two groups received Diabetes Education, Diabetic diet, internal medicine oral hypoglycemic agents or subcutaneous injections of insulin (the dose were set according to blood glucose levels of the patients); the patients who combined with hypertension were added nifedipine sustained release tablets, 10～20 mg, 2 times/day. The patients who combined with hyperlipidemia were added Simvastatin, 20 mg/day. The observation group used Self-prepared kidney invigorating decoction on the basis of the control group. Both groups had 8 weeks for a course of treatment, urinary protein excretion rate (uAER) and the protein and mRNA change of VEGF in the two groups were compared before and after the treatment.Results:1) uAER improved in the two groups after treatment compared to before the treatment, the range of improvement in the observation group was more obvious (P<0.05). This illustrated that Self-prepared kidney invigorating decoction can obviously significantly improve uAER of the patients with diabetic nephropathy, inhibited the progression of diabetic nephropathy in a certain extent. 2) after treatment, protein and mRNA expression of VEGF in the two groups decreased, the downward trend in the observation group were more obvious than the control group (P<0.05), illustrated the combine use of prescription could suppress the VEGF in the protein and gene levels. 3) uAER and VEGF levels were in abnormal distribution, correlation analysis were proceed on relevant parameters by the method of Spearman, the results found that uAER had positive correlation with the expression of VEGF.Conclusion:Spleen-yang Strengthening Decoction can reduce the serum VEGF level in patients with diabetic nephropathy, and can reduce uAER at the same time, which could possibly be the mechanism of action to protect renal function.

Diabetic nephropathy; Urinary protein excretion rate; Vascular endothelial growth factor; S Spleen-yang Strengthening Decoction

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于腎陽(yáng)虛體質(zhì)研究少、長(zhǎng)、壯、老腎陽(yáng)盛衰的基因調(diào)控”(編號(hào)：30973690)

曾偉平(1982—)，碩士，主治中醫(yī)師，四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，研究方向：慢性腎臟病中西醫(yī)臨床治療

R243;R587.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.015