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    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量

    2015-01-05 08:21:24劉延平于薈馬文平王魯霞李建新
    化學(xué)分析計量 2015年6期
    關(guān)鍵詞:鯊烯油用花蕊

    劉延平,于薈,馬文平,王魯霞,李建新

    (菏澤市產(chǎn)品檢驗檢測研究院食品檢驗中心,山東菏澤 274000)

    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量

    劉延平,于薈,馬文平,王魯霞,李建新

    (菏澤市產(chǎn)品檢驗檢測研究院食品檢驗中心,山東菏澤 274000)

    建立氣相色-譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定油用牡丹花蕊及花粉中角鯊烯含量的方法。牡丹花蕊及花粉經(jīng)索氏抽提法提取脂肪后,用氫氧化鉀-乙醇溶液皂化,石油醚萃取凈化,正己烷溶解,提取物經(jīng)HP-5MS柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明:油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量分別為2.73,1.75 g/kg。在0.08~400 mg/L范圍內(nèi)角鯊烯含量與定量離子m/z69的峰面積線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.999 6,方法的檢出限為11 ng/kg。在1.00~3.00 g/kg范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,平均回收率為92.5%~102.6%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%~5.3%(n=6)。該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,適用于油料植物和植物油中角鯊烯含量的測定。

    油用牡丹;牡丹花蕊;牡丹花粉;角鯊烯;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

    角鯊烯(化學(xué)名為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物,為無色或黃色透明油狀液體,是從深海鯊魚肝油中提煉而成[1-5]。它具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、促進(jìn)新陳代謝、提高機(jī)體免疫力、降低血清總膽固醇、防止動脈粥樣硬化[6-7]和抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能,是一種無毒性的生物活性物質(zhì)[8-9],因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域[10-11]。Bakes M J[12]指出角鯊烯主要來源于深海鯊魚肝油,植物性產(chǎn)品橄欖油中角鯊烯含量也較高[13]。

    牡丹是我國特有的木本名貴花卉,其花大、色艷、型美、香濃,極具觀賞性,不僅花美,其根可入藥,稱為“丹皮”,具有清熱涼血、活血化瘀的功效[14],因此,牡丹一直被用作觀賞花卉和藥用植物。牡丹籽油是由油用牡丹種籽生產(chǎn)的一種新型木本植物油,其不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%,其中α-亞麻酸占40%以上,具有很高的營養(yǎng)價值。國務(wù)院指出要大力發(fā)展木本油料產(chǎn)業(yè),加快推進(jìn)牡丹籽油生產(chǎn)基地建設(shè),開發(fā)利用新的木本植物油資源,實現(xiàn)牡丹產(chǎn)業(yè)化。伴隨著油用牡丹大規(guī)模種植,大量牡丹副產(chǎn)物—牡丹花蕊和花粉引起了人們的關(guān)注,成為了中國特有的營養(yǎng)產(chǎn)品,如不能加以利用將會造成資源大量浪費。牡丹不產(chǎn)花蜜,為風(fēng)媒木本植物,因此牡丹花粉不被蜜蜂等其它昆蟲采收污染,質(zhì)量好、產(chǎn)量高。由牡丹花蕊沖泡的茶,色澤金黃,清香宜人[15],初步試服結(jié)果表明,牡丹花蕊對男性前列腺疾病有獨特效果。牡丹花蕊、花粉營養(yǎng)價值極高,但是對其含有的生物活性物質(zhì)的研究,國內(nèi)外很欠缺,成分的研究也只是局限于某類成分的總體分析,并未對單體成分進(jìn)行定量。因此筆者選擇了合適的分離提取技術(shù)提取牡丹花蕊和花粉中的天然功效成分角鯊烯,并對其進(jìn)行了定性和定量分析,目前國內(nèi)外還沒有這方面研究的報道。筆者建立了樣品皂化后,經(jīng)石油醚萃取凈化,正己烷溶解,氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行牡丹花蕊和花粉中功能性成分角鯊烯含量的定量檢測方法。與毛多斌[16]和謝勇[17]的研究相比,本方法優(yōu)于用正己烷溶解后直接進(jìn)樣,因為直接進(jìn)樣干擾大,峰型容易變形,且對氣相的襯管、毛細(xì)管柱以及質(zhì)譜檢測器污染大。由于角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物[18],因此筆者先將油脂皂化脫脂,然后用石油醚萃取提取角鯊烯。該方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,峰型尖銳且干擾峰少,目標(biāo)峰分離效果好,定量準(zhǔn)確。

    1 實驗部分

    1.1 主要儀器與試劑

    氣相色譜儀(7890A型)串聯(lián)質(zhì)譜儀(5975C型):美國安捷倫科技有限公司;

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE52AA型,菏澤市鑫源儀器儀表有限公司;

    電熱恒溫水浴鍋:XMTD-4000型,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;

    數(shù)控超聲波清洗器:KQ-500DB型,昆山市超聲儀器有限公司;

    電子天平:AL204型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;

    角 鯊 烯 標(biāo) 準(zhǔn) 品:99.5%,0.5 mL/支,批 號140721-200601,中國藥品生物制品檢定所;

    正己烷:色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

    石油醚:分析純,沸程30~60℃,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;

    KOH:分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;

    NaCl、無水硫酸鈉、無水乙醇:分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

    牡丹花蕊和花粉:山東菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司。

    1.2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備

    準(zhǔn)確稱取0.100 0 g角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,加適量正己烷,振蕩超聲使之完全溶解,再用正己烷定容至標(biāo)線,混勻,制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

    1.3 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備

    利用1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制0.04~800 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液,進(jìn)行線性和檢出限實驗。

    1.4 樣品處理

    按照國標(biāo)GB/T 5009.6-2003中第一法索氏抽提法提取花蕊和花粉中的脂肪。稱取0.2 g左右所提取的脂肪樣品,放入50 mL錐形瓶中,加入25 mL的2 mol/L KOH-乙醇溶液,置于85℃恒溫水浴鍋中皂化1 h,冷卻后轉(zhuǎn)移至150 mL分液漏斗中,分別加入25 mL飽和氯化鈉溶液和石油醚,振蕩萃取1 min,靜置分層后,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入150 mL分液漏斗中,下層皂化液再分別用25 mL和15 mL石油醚萃取兩次,將合并的3次萃取液用去離子水洗至中性,經(jīng)無水硫酸鈉脫水后,于30℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用正己烷定容至10 mL,取上清液用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

    1.5 儀器工作條件

    1.5.1 色譜條件

    色譜柱:HP-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×250 μm,0.25 μm,美國安捷倫科技有限公司);升溫程序:200℃保持0 min,以40℃/min升至280℃,保持10 min;進(jìn)樣口溫度:280℃;載氣:高純氦氣,流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量:1 μL。

    1.5.2 質(zhì)譜條件

    離子源:電子轟擊離子源(EI);離子源溫度:230℃;四級桿溫度:150℃;采集模式:選擇離子監(jiān)測;溶劑延遲:3.00 min;定量離子:m/z69;定性離子:m/z81,95,137。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 角鯊烯的定性與定量離子選擇

    對角鯊烯標(biāo)樣通過質(zhì)譜全掃描模式得到質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11.L做相似度檢索匹配度為99%,確定其主要的碎片離子的質(zhì)荷比m/z69,81,95,137,再設(shè)置選擇離子監(jiān)測模式,選擇檢測離子為m/z69,81,95,137。在選擇離子監(jiān)測模式對目標(biāo)物進(jìn)行定量時,通常選擇靈敏度高且抗擾能力強(qiáng)的碎片離子作為目標(biāo)物定量的離子,實驗選擇定量離子為m/z69,定性離子為m/z81,95,137。角鯊烯的總離子流圖和質(zhì)譜圖分別見圖1、圖2。

    圖1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

    圖2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖

    2.2 樣品中角鯊烯的定性與定量

    通過與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和面積相對比,確定樣品中角鯊烯的含量。牡丹花蕊和花粉提取的脂肪中角鯊烯的總離子流圖分別見圖3、圖4,質(zhì)譜圖分別見圖5、圖6。

    圖3 牡丹花蕊的總離子流圖

    圖4 牡丹花粉的總離子流圖

    從圖3、圖4可以看出,樣品中角鯊烯色譜峰基線穩(wěn)定,目標(biāo)峰峰型尖銳,重現(xiàn)性好,并能與其它干擾峰較好地區(qū)分開來。由圖5和圖6的質(zhì)譜峰可以看出提取物的質(zhì)譜峰與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜峰相近,與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11.L做相似度檢索匹配度為96%,因此可以確定提取物是角鯊烯。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣品中的角鯊烯進(jìn)行定量。

    圖5 牡丹花蕊的質(zhì)譜圖

    圖6 牡丹花粉的質(zhì)譜圖

    2.3 色譜條件選擇

    由于角鯊烯是一種高度不飽和烴類化合物,相對分子質(zhì)量大,沸點高(280℃),難揮發(fā),故選用HP-5MS非極性耐高溫(325℃)毛細(xì)管柱,進(jìn)樣口溫度280℃,分離效果好,峰型尖銳,干擾少,此色譜條件適用于角鯊烯的測定。

    2.4 線性方程、線性范圍和檢出限

    利用1 000 mg/L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成0.04,0.08,0.16,0.40,1.60,4.00,8.00,16.00,40.00,80.00,120.00,400.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液,試驗發(fā)現(xiàn)0.04和800 mg/L這兩個點偏離了線性范圍,因此方法的線性范圍是0.08~400 mg/L。按照設(shè)定的色譜條件,以角鯊烯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),定量離子m/z69的峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得線性方程為y=9.962×105x-9.816×105,線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。當(dāng)信噪比(S/N)為3時,角鯊烯的檢出限為11 ng/kg。

    2.5 精密度試驗

    對牡丹花蕊和牡丹花粉樣品重復(fù)測定6 次,結(jié)果見表1。由表1可知,牡丹花蕊和牡丹花粉中角鯊烯測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%,5.3%,說明該方法具有良好的精密度。

    表1 精密度試驗結(jié)果

    2.6 回收試驗

    在牡丹花蕊和牡丹花粉樣品中,分別添加1.00,2.00,3.00 g/kg的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品,前處理方法同1.4,測定后計算回收率,結(jié)果見表2。

    表2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    由表2可見,回收率在92.5%~102.6%之間,說明該方法的加標(biāo)回收率滿足方法學(xué)要求,適合角鯊烯含量的測定。

    2.7 樣品測定

    實驗中選取了油用牡丹花蕊和花粉作為樣品,按照實驗方法測定了其中的角鯊烯含量,結(jié)果見表1,其平均值分別為2.73,1.75 g/kg,此結(jié)果表明:牡丹花蕊和花粉中含有大量的角鯊烯,其含量要遠(yuǎn)高于一般植物油如花生油、大豆油、亞麻籽油、葵花籽油等。

    3 結(jié)論

    采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定牡丹花蕊和花粉中功能性成分角鯊烯的含量。結(jié)果表明,此方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,峰型尖銳且干擾峰少,目標(biāo)峰分離效果好,定量準(zhǔn)確。牡丹花蕊和花粉中的角鯊烯含量很高,這對開發(fā)其藥用和食用價值、指導(dǎo)牡丹產(chǎn)業(yè)的深加工、深度挖掘油用牡丹的應(yīng)用價值、促進(jìn)油用牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和提高資源利用率有一定的意義。關(guān)于牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量的測定國內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報道,因此本課題的研究對以后角鯊烯的研究有一定的指導(dǎo)意義。

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    Determination of Squalene in Peony Stamen and Pollen for Oil by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

    Liu Yanping, Yu Hui, Ma Wenping, Wang Luxia, Li Jianxin
    (Heze Institute of Product Inspection and Testing, Food Inspection Center, Heze 274000, China)

    A method for quantitative of squalene in peony stamen and pollen for oil was determined by GC-MS. The peony stamen and pollen oil was extracted by Soxhlet extraction. The extracted oil samples were saponified with potassium hydroxide-ethanol solution,extracted with petroleum ether and dissolved withn-hexane. The extracted solutions were separated on a HP-5MS column and determined with mass spectrometer. The squalene content in oil peony stamen and pollen were 2.73 and 1.75 g/kg. The contents of squalene had good linear relationship in the range of 0.08-400 mg/L with the peak area of quantitative ionm/z69,and the correlation coefficient reached 0.999 6. The method of detection limit was 11 ng/kg. The recoveries of squalene ranged from 92.5% to 102.6% at fortification levels of 1.00-3.00 g/kg,and the relative standard deviation was 3.4%-5.3%(n=6). This method has good accuracy and repeatability which can be applied to the determination of squalene in oil plants and vegetable oil.

    peony for oil; peony stamen; peony pollen; squalene; gas chromatograph-mass spectrometry

    O657.63

    :A

    :1008-6145(2015)06-0052-04

    10.3969/j.issn.1008-6145.2015.06.013

    聯(lián)系人:劉延平;E-mail: 2005013004@163.com

    2015-07-08

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