HPLC-TOF-MS分析澤瀉提取物中三萜類化合物*

鄧岳，劉阿娜，王小明，周洪雷，李運(yùn)倫，蔣海強(qiáng)

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院高血壓病中醫(yī)臨床研究中心，濟(jì)南 250011；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250355)

HPLC-TOF-MS分析澤瀉提取物中三萜類化合物*

鄧岳1，劉阿娜1，王小明1，周洪雷1，李運(yùn)倫2，蔣海強(qiáng)3

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院高血壓病中醫(yī)臨床研究中心，濟(jì)南 250011；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250355)

分析和鑒定澤瀉提取物中的化學(xué)成分。釆用高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-TOF-MS)，在正離子檢測(cè)模式下用全掃描方式獲得高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件、PCDL、數(shù)據(jù)庫(kù)和參考文獻(xiàn)，總結(jié)已知化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)澤瀉中的三萜類成分進(jìn)行定性鑒別。澤瀉提取物中共鑒定了22種三萜化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為澤瀉的物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究提供了理論依據(jù)。

澤瀉；三萜類；化學(xué)成分；高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientalis (Sam.) Juzep.]的干燥塊莖，性寒味甘，具有利水滲濕、泄熱的功效，可用于小便不利、水腫脹滿、痰飲眩暈、高脂血等癥［1］?，F(xiàn)代研究表明其具有利尿［2］、降血脂［3］、抗氧化、保肝［4］的作用。三萜類化合物是澤瀉的主要化學(xué)成分，如澤瀉醇A(alisol A)及其衍生物24-乙酰澤瀉醇A等，具有一系列藥理活性［5-7］。高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-TOF-MS)法分辨能力強(qiáng)，在全掃描的模式下可保證微量成分不被遺失，從而獲得大量、有效的化合物結(jié)構(gòu)鑒定信息，是一種快速有效的化合物鑒定方法［8-9］。

目前對(duì)澤瀉整體藥效機(jī)制評(píng)價(jià)與總體藥物化學(xué)成分研究較多，但采用HPLC-TOF-MS法對(duì)其中的三萜類化合物的系統(tǒng)研究尚不多見。因此為了進(jìn)一步明確澤瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者對(duì)澤瀉的有效成分進(jìn)行了提取，采用HPLC-TOF-MS法對(duì)澤瀉提取物中的三萜類化合物進(jìn)行全面系統(tǒng)的定性鑒定，建立藥材質(zhì)譜指紋圖譜，為澤瀉的綜合利用開發(fā)提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：Agilent 1260 LC-6230 TOF-MS型，美國(guó)安捷倫公司；

純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司；

分析天平：CP225D型，德國(guó)SARTORIUS公司；

澤瀉藥材：澤瀉的干燥塊莖；

24-乙酰澤瀉醇A對(duì)照品：批號(hào)18674-16-3，20 mg／支，純度不小于98%，色譜純，北京寶賽希望生物科技有限公司；

23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品：批號(hào)26575-95-1，20 mg／支，純度不小于98%，北京寶賽希望生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；

實(shí)驗(yàn)用其它試劑均為分析純。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

取24-乙酰澤瀉醇A及23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，稀釋至所需濃度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.3 供試品溶液的制備

將干燥的澤瀉藥材1.0 kg粉碎，過3號(hào)篩。每次準(zhǔn)確稱取澤瀉粗顆粒500 g，加入以10倍藥材量的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1.0 h，合并提取液，回收乙醇。藥渣再以10倍量的水加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，蒸發(fā)水分。合并提取物并濃縮為浸膏(每mL含有1 g澤瀉生藥)。將藥材浸膏用甲醇溶解、稀釋，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得濃度為50 mg／mL的澤瀉供試品溶液。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Halo C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國(guó)AMT公司)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流速為0.3 mL／min；進(jìn)樣體積：2 μL；梯度洗脫：0～3 min 5% B，3～12 min 5%～12% B，12～29 min 12%～16% B，29～39 min 16%～18% B，39～49 min 18%～21% B，49～53 min 21%～25% B，53～58 min 25%～30% B，58～65 min 30%～36% B，65～73 min 36%～42% B，73～79 min 42%～52% B，79～83 min 52%～65% B，83～98 min 65%～75% B，98～100 min 100% B。

1.5 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣流速：11 L／min；噴霧氣壓力：241.3 kPa(35 psi)；干燥氣溫度：350℃；碎片電壓：90，180，30，360 V；數(shù)據(jù)采集范圍：m／z50～1 000；選取m／z121.050 9，922.009 8的內(nèi)標(biāo)離子作參比離子。每次測(cè)定樣品前，采用調(diào)諧液(Turning mixture)校準(zhǔn)質(zhì)量軸。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥材提取方法的建立

澤瀉藥材發(fā)揮其藥理作用的有效成分主要為澤瀉三萜類化合物，屬于醇溶性物質(zhì)，大多采用乙醇提取工藝［10-12］。采用10倍量乙醇加熱回流提取，為最大限度地避免目標(biāo)成分的遺失，再對(duì)藥渣采取10倍量的水加熱回流提取，使藥材中可能存在的苷類物質(zhì)也能被提取得到。

2.2 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相的篩選過程中，使用乙腈作為有機(jī)相，水相的選擇分別對(duì)正離子模式下0.1%甲酸溶液，3 mmol/L乙酸銨溶液，3 mmol/L乙酸銨-0.2%乙酸溶液，5 mmol/L乙酸銨-0.1% 氨水（pH 7.0）體系及負(fù)離子模式下的0.1%甲酸溶液進(jìn)行考察。結(jié)果表明采用正離子模式下0.1%甲酸溶液可以獲得較好的峰形和分離度，質(zhì)譜響應(yīng)良好。故選用正離子模式下0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

2.3 碎裂電壓的選擇

在質(zhì)譜分析過程中同時(shí)設(shè)置90，180，300，360 V 4個(gè)離子源內(nèi)碎裂電壓，使化合物分子吸收能量后產(chǎn)生電離，生成分子離子，之后進(jìn)一步按照化合物自身特有的碎裂規(guī)律分裂，適當(dāng)增加碎裂電壓，減少簇離子的產(chǎn)生，并同時(shí)得到一系列典型的與結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子信息，便于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析。

2.4 定性方法的建立

2.4.1 數(shù)據(jù)處理軟件

澤瀉中存在的萜類成分極性較小，在95 min內(nèi)得到了較好的有效分離，正離子模式下的特征離子主要為［M+H］+和［M+Na］+，通過一級(jí)質(zhì)譜獲得了高分辨的質(zhì)核比，利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件在查找到化合物的精確質(zhì)量數(shù)后，將質(zhì)譜測(cè)量誤差設(shè)置在±5×10-6范圍內(nèi)，計(jì)算出該質(zhì)荷比所代表的化合物可能的元素組成，篩選最可能的化合物分子式，觀察其同位素分布情況并進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.2 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

通過澤瀉化學(xué)成分研究文獻(xiàn)及NCBI，CNKI，CA國(guó)內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)等收集了澤瀉［6-7，13-19］中的106個(gè)化合物，采用安捷倫PCDL軟件建立包括化合物名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量的相應(yīng)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。通過檢索PCDL化合物數(shù)據(jù)庫(kù)以及與文獻(xiàn)總結(jié)中列出的化學(xué)成分再次比對(duì)，初步推斷澤瀉供試品溶液中的化學(xué)成分。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)

采用標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B及24-乙酰澤瀉醇A在相同條件下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子離子和特征碎片離子比對(duì)可以確定，在正離子模式下91.077，84.473 min處分別為23-乙酰澤瀉醇B及24-乙酰澤瀉醇A。

2.5 成分鑒定結(jié)果

澤瀉提取物的HPLC-TOF-MS總離子流圖見圖1。三萜類成分結(jié)構(gòu)母核相同，是一類基本母核由30個(gè)碳原子組成的化合物。澤瀉中的三萜類成分多為原萜烷型四環(huán)三萜［5］，其結(jié)構(gòu)具有一定的特征，如C-10位和C-14位上有β-CH3，C-20位上有S構(gòu)型等，在質(zhì)譜裂解中呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)及歸屬見表1，共鑒別出22種化合物。

圖1 澤瀉提取物的HPLC-TOF／MS總離子流圖

表1 澤瀉的化學(xué)成分鑒別結(jié)果

續(xù)表1

3 結(jié)語(yǔ)

采用HPLC-TOF-MS法對(duì)澤瀉提取物中的三萜類成分進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分分析，共計(jì)鑒別了22種化合物，初步確定了澤瀉提取物中的主要有效成分，為進(jìn)一步深入研究澤瀉的化學(xué)成分含量及開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考。

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中物院近4.5億元科學(xué)儀器向社會(huì)開放

為進(jìn)一步加速軍民融合，助力創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)，不久前，中物院大型科學(xué)儀器開放共享平臺(tái)——中物院理化分析與無損檢測(cè)協(xié)作網(wǎng)在綿陽(yáng)上線。網(wǎng)站將整合中物院300余臺(tái)套，總價(jià)值近4.5億元的理化分析與無損檢測(cè)設(shè)備向社會(huì)開放共享，為全國(guó)科研院所、科技企業(yè)提供全方位的分析檢測(cè)技術(shù)服務(wù)。

此次對(duì)外開放的設(shè)備包括分析檢測(cè)、性能測(cè)試、無損檢測(cè)、計(jì)量、環(huán)境監(jiān)測(cè)等10余種類，分析檢測(cè)對(duì)象包括金屬材料、高分子材料、無機(jī)材料、放射性材料、電子材料等多種金屬及非金屬材料；檢測(cè)范圍涉及生物醫(yī)藥、電子技術(shù)、機(jī)械加工、食品安全、航空航天、環(huán)保技術(shù)、汽車制造及新材料等領(lǐng)域。

此前國(guó)務(wù)院印發(fā)《關(guān)于國(guó)家重大科研基礎(chǔ)設(shè)施和大型科研儀器向社會(huì)開放的意見》。意見指出，近年來，科研設(shè)施與儀器規(guī)模持續(xù)增長(zhǎng)，技術(shù)水平明顯提升。同時(shí)，科研設(shè)施與儀器利用率和共享水平不高的問題也逐漸凸顯出來，閑置浪費(fèi)現(xiàn)象比較嚴(yán)重?；谏鲜銮闆r，意見要求，加快推進(jìn)科研設(shè)施與儀器向社會(huì)開放，進(jìn)一步提高科技資源利用效率。

（科學(xué)日?qǐng)?bào)）

Analysis of the Triterpenes in the Extract of Alisma Orientalis (Sam.) Juzep by HPLC-TOF-MS

Deng Yue1, Liu Ana1, Wang Xiaoming1, Zhou Honglei1, Li Yunlun2， Jiang Haiqiang3
（1. Pharmacy College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355， China; 2. Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base for Hypertension of Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011，
China; 3. Experimental Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355， China）

The chemical constituents of the extract of Alisma orientalis (Sam.) Juzep were analyzed and authenticated. HPLC-TOF-MS technology was applied for high resolution mass spectrometry data operated in positive ion mode in full scan mode. With Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis software，PCDL database and references，separating components in Alisma orientalis (Sam.)Juzep，based on the summary of fragmentation regularities of known chemical composition, 22 triterpene compounds were identified. The experimental results further enrich the research content of the chemical composition and provide certain theoretical basis for material basis and quality control of Alisma orientalis (Sam.)Juzep.

Alisma orientalis (Sam.) Juzep; triterpenes; chemical constituent; HPLC-TOF／MS

O657.7

：A

：1008-6145(2015)06-0011-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.06.003

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(81273700，81102549)

聯(lián)系人：蔣海強(qiáng)；E-mail: jhq12723@163.com

2015-07-26