復方柴胡袋泡茶的質(zhì)量標準*

許本善，雷寧，陳靖婕，常子倩，馬萍，童衛(wèi)杭

(解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學部，北京 100088)

復方柴胡袋泡茶的質(zhì)量標準*

許本善，雷寧，陳靖婕，常子倩，馬萍，童衛(wèi)杭

(解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學部，北京 100088)

目的完善復方柴胡袋泡茶的質(zhì)量控制標準，保障制劑質(zhì)量。方法采用薄層色譜(TLC)法對制劑中的柴胡、葛根、連翹進行定性鑒別，用高效液相色譜(HPLC)法對制劑中的葛根素進行含量測定。色譜條件：色譜柱為島津VP-ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(23：77)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為250 nm。結(jié)果TLC斑點清晰，分離度良好，陰性對照無干擾；葛根素線性范圍為1.340 8～56.632 8 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)，平均加樣回收率102.98%，RSD為1.48%(n=6)。結(jié)論該方法簡便易行，適用于復方柴胡袋泡茶的質(zhì)量控制。

柴胡袋泡茶，復方；葛根素；色譜法，薄層；色譜法，高效液相；含量測定

復方柴胡袋泡茶系我院醫(yī)院制劑，具有解肌發(fā)表，清熱解毒，清利頭目，發(fā)散風熱，清理除煩之功效，適用于流感、普通感冒及肺炎、化膿性扁桃體炎等引起的發(fā)熱。該制劑處方由柴胡、葛根、黃芩、青蒿、連翹、浙貝、生石膏等12味藥材組成，來源于我院多年臨床經(jīng)驗，療效確切。該制劑原質(zhì)量標準制定于上世紀90年代，未對其中主要藥味及其活性成分進行定性、定量檢測。為了更好地控制制劑質(zhì)量，本研究增加了制劑中柴胡、葛根、連翹的薄層鑒別，同時建立高效液相色譜法對制劑中葛根素的含量進行測定。實驗結(jié)果表明，所建方法操作簡便、靈敏度好、重復性佳，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超聲波清洗器(KQ-500V型，昆山超聲儀器有限公司)；高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津LC-20A，包括DGU-20A3型脫氣機、LC-20AT型溶劑輸送泵、SIL-20A型自動進樣器、CTO-20A型柱溫箱、SPD-20A型紫外-可見檢測器，以及LC Solution色譜工作站)；電子天平(JM-B20002型，浙江省余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司，感量：0.1 mg)；分析天平(Sartorius，CP225D型，感量：0.01 mg)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥 硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；柴胡皂苷a對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110777-201108，含量：90.50%)、柴胡皂苷d對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110778-201208，含量：94.60%)、葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110752-201313，含量：95.50%)、連翹苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110821-201213，含量：95.30%)；復方柴胡袋泡茶[醫(yī)院制劑，批準文號：總制字(2011)F07002，批號：20130417，20131216，20140418]；甲醇為色譜純，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 柴胡 取制劑粉末(批號：20140418，過篩孔內(nèi)徑0.250 mm篩)6.5 g，置具塞錐形瓶中，加5%濃氨水試液的甲醇溶液100 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理30 min，濾過，用甲醇分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘渣加20 mL水溶解，再用飽和正丁醇提取，反復提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，回收正丁醇至干，甲醇溶解，并定容至5 mL，搖勻，作為供試品溶液。另取北柴胡對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的對照品適量，分別加甲醇制成每毫升含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液[1]。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅥB]實驗，吸取上述供試品溶液和對照品溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，于60 ℃下加熱至斑點顯色清晰，紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點，陰性樣品無干擾(圖1)。

1，2.樣品；3.柴胡皂苷a；4.柴胡皂苷d；5.北柴胡對照藥材；6，7.陰性樣品

圖1 柴胡的薄層色譜圖(溫度：4 ℃；相對濕度：50%)

1，2.sample；3.saikosaponin a；4.saikosaponin d；5.reference ofBupleurumchinenseDC.；6，7.negative sample

Fig.1 TLC chromatogram ofBupleurumchinenseDC. (temperature: 4 ℃; relative humidity: 50%)

2.1.2 葛根 取制劑粉末(批號：20140418， 過篩孔內(nèi)徑0.300 mm篩)10 g，加甲醇100 mL，放置2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取葛根對照藥材0.8 g，同法制成對照藥材溶液。再取葛根素對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液[2]。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅥB]實驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，使成條狀，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光條斑。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(圖2)。

1，4.葛根對照藥材；2，3.樣品；5，6.陰性樣品；7.葛根素對照品

圖2 葛根的薄層色譜圖(溫度：4 ℃；相對濕度：50%)

1，4.RadixPuerariaeLobatae；2，3.sample；5，6.negative samples；7.puerarin reference

Fig.2 TLC chromatogram ofRadixPuerariaeLobatae(temperature: 4 ℃; relative humidity: 50%)

2.1.3 連翹 取制劑粉末(批號：20140418，過篩孔內(nèi)徑0.180 mm篩)15 g，加石油醚(30～60 ℃)50 mL，密塞，超聲處理15 min，濾過，棄去石油醚液，殘渣于通風櫥中揮干石油醚，再加入甲醇50 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液[2]。再取連翹苷對照品，加甲醇制成每毫升含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅥB]實驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5：3：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。經(jīng)陰性對照實驗，結(jié)果陰性對照溶液無干擾(圖3)。

1，4，7.連翹苷對照品；2，3.陰性樣品；5，6.樣品

圖3 連翹的薄層色譜圖(溫度：4 ℃；相對濕度：50%)

1,4,7.Phillyrinreference; 2,3. negative sample; 5,6. sample

Fig.3 TLC chromatogram ofForsythiasuspensa(temperature: 4 ℃; relative humidity: 50%)

2.2 葛根素含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：島津 VP-ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液(23：77)；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計算應不低于4 500，分離度>1.5[3]。分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，供試品與對照品在相同位置有吸收，陰性樣品無干擾。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品6.25，12.50 mg分別置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為儲備液；精密量取0.25 mg·mL-1儲備液1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，濃度為10 μg· mL-1。

2.2.3 供試品溶液的制備 取制劑(批號：20130417)10袋，混勻，過篩孔內(nèi)徑0.300 mm篩，稱取篩下制劑粉末約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(500 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方量比例及制備工藝，取缺葛根的其他藥材制備陰性樣品。精密稱取陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取葛根素對照品貯備液(0.25 mg· mL-1)0.5，1.0，2.0 mL至10 mL 量瓶中，用色譜純甲醇定容，分別標記為4～6號。另分別取0.5 mL葛根素對照品貯備液(0.25 mg·mL-1)至100，50，25 mL量瓶中，甲醇定容，標記為1～3號。分別精密吸取上述溶液各10 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件測定。以峰面積積分值(Y)對葛根素進樣濃度(X)進行線性回歸，得到葛根素的回歸方程為：Y=43 347X+7 444.3(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，葛根素在1.340 8～53.632 8 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度實驗 取對照品溶液，重復進樣6次，進樣量10 μL，在上述色譜條件下求得葛根素峰面積的RSD為0.38%(n=6)。

2.2.7 重復性實驗 取供試品(批號：20130417)共6份，分別按“2.2.3”方法制備供試品溶液，進行測定，求得葛根素含量的RSD為1.10%(n=6)，表明重復性較好。

A.陰性對照溶液；B.對照品溶液；C.樣品溶液；1.葛根素

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，在0，1，2，3，5，10 h分別進行測定。結(jié)果表明樣品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定，葛根素峰面積的RSD為0.16%(n=6)。

2.2.9 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(批號：20130417)的樣品約0.12 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入葛根素對照品貯備液(0.50 mg·mL-1)1 mL，按“2.2.3”項下方法制備即得。精密吸取上述供試液10 μL注入色譜儀，測定含量，結(jié)果平均回收率102.98%(RSD=1.48%，n=6)。見表1。

表1 葛根素加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of puerarin

取樣量/g原有量加入量測得量mg回收率/%0．12120．41450．48710．9140102．550．12140．41520．48710．9072101．010．12140．41520．48710．9243104．520．12140．41520．48710．9270105．070．12170．41620．48710．9141102．220．12130．41480．48710．9141102．50

2.2.10 樣品含量測定 取3批(批號：20130417，20131216，20140418)復方柴胡袋泡茶制劑，按“2.2.2”及“2.2.3”項下方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進行測定并計算含量。結(jié)果葛根素含量依次為3.42，3.28，3.35 mgg-1，RSD分別為2.43%，2.69%，1.10%。

3 討論

3.1 薄層鑒別藥材的選擇 在薄層鑒別過程中還對處方中除了柴胡、葛根、連翹以外的其他9味藥材進行了考察，均無法排除陰性樣品的干擾，故未納入質(zhì)量標準。

3.2 含量測定指標性成分的選擇 本研究最初選用黃芩苷作為制劑含量測定的指標性成分，先后選用“加

熱回流”[2]、“超聲提取”[4]、“AB-8大孔樹脂分離”[5]等前處理方法摸索供試品的制備，同時優(yōu)化色譜條件，但發(fā)現(xiàn)其陰性樣品中始終存在不同程度的干擾，故重新選取葛根素為含量測定的指標性成分。

3.3 流動相的選擇 實驗中曾考察了以甲醇-水(25：75)為流動相，但葛根素分離度和峰形均不佳[2]；而以甲醇-0.2%磷酸溶液(23：77)為流動相時，葛根素峰形對稱，分離度良好[6]。

3.4 含量測定中供試品制備條件的選擇 首先考察了回流、超聲兩種提取方法，結(jié)果顯示超聲提取的效果較好且操作簡便；其次，對提取溶劑(30%甲醇、30%乙醇)進行了考察，結(jié)果顯示，30%乙醇提取效果稍優(yōu)于30%甲醇，兼顧環(huán)保無毒，選擇30%乙醇作為提取溶劑；第三，考察了超聲提取時間，結(jié)果表明30 min以后樣品中葛根素的含量不再增加。因此，最終確定供試品處理方法為30%乙醇超聲處理30 min。

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《臨床外科雜志》征訂啟事

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Quality Standard for Compound Chaihu Tea

XU Benshan, LEI Ning, CHEN Jingjie, CHANG Ziqian, MA Ping, TONG Weihang

(DepartmentofPharmacy,theSecondArtilleryGeneralHospitalofChinesePeople'sLiberationArmy,Beijing100088,China)

Objective To improve the quality standard of compoundChaihutea. MethodsPupleuriRadix,PuerariaeLobataeRadixandForsythiaeFructuswere identified by thin layer chromatography (TLC).HPLC method was used to determine the content of puerarin.The determination was performed on aShimadzuVP-ODS-C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) with the mobile phase of methanol-0.2% H3PO4(23：77).The flow rate was 1.0 mL·min-1, the column temperature was set at 30 ℃ and the detection wavelength was 250 nm. Results The TLC spots were clear and well-separated without negative interference.The good linear correlation existed within the range of 1.340 8-56.632 8 μg· mL-1for puerarin (r=0.999 9,n=6) and the average recovery was 102.98% with RSD being 1.48% (n=6). Conclusion The method is simple and accurate.It can be used for quality control of compoundChaihutea.

Chaihutea, compound； Puerarin； Chromatography, thin layer； Chromatography, high performance liquid； Content determination

2015-01-20

2015-03-04

*全軍醫(yī)療機構制劑標準提高科研專項課題面上項目(13ZJZ19-2)

許本善(1987-)，男，山東德州人，藥師，學士，研究方向：中藥質(zhì)量控制。電話：(0)18911632870， E-mail：benshan.xu@163.com。

雷寧(1978-)，女，陜西咸陽人，主管藥師，博士，研究方向：天然藥物藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制。電話：010-66343245(轉(zhuǎn)8002)，E-mail：lilyzebra@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1640-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.023