蓮子心中酚性與非酚性生物堿體外抗氧化活性比較

楊小青，宋金春，謝順嵐，郝好華

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072)

蓮子心中酚性與非酚性生物堿體外抗氧化活性比較

楊小青1，宋金春1，謝順嵐2，郝好華1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072)

目的比較蓮子心中酚性生物堿與非酚性生物堿的體外抗氧化活性。方法采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)-二銨鹽(ABTS)、羥基自由基清除、超氧陰離子自氧化，還原力及β-胡蘿卜素漂白測(cè)試等方法評(píng)估蓮子心中生物堿的抗氧化活性。結(jié)果總生物堿、酚性生物堿、非酚性生物堿對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)分別為21.89，27.10，32.87 μg·mL-1；對(duì)ABTS自由基的IC50分別為14.25，20.55，25.94 μg·mL-1；對(duì)羥基自由基清除IC50分別為0.03，0.03，0.08 μg·mL-1；超氧陰離子自氧化速率分別為8.72×10-4，5.87×10-4，6.68×10-4；還原力大?。嚎偵飰A>酚性生物堿>非酚性生物堿；脂質(zhì)抑制率分別為89.63%，85.85%，83.78%。結(jié)論蓮子心中酚性生物堿對(duì)自由基的清除活性、還原力、抗脂質(zhì)過氧化活性強(qiáng)于非酚性生物堿，具有廣闊的應(yīng)用前景。

蓮子心；酚性生物堿；非酚性生物堿；抗氧化活性；體外

在環(huán)境、年齡、心理、生理疲勞等多種因素共同作用下，體內(nèi)的活性氧會(huì)產(chǎn)生一系列的病理作用，例如引起DNA損傷、致癌、細(xì)胞功能衰退導(dǎo)致機(jī)體老化等[1]。越來越多的研究者致力于尋找天然抗氧化劑，以彌補(bǔ)化學(xué)抗氧化劑自身的缺陷。生物堿是蓮子心中主要的活性成分，其中酚性生物堿主要為雙芐基異喹啉類生物堿，此類生物堿結(jié)構(gòu)類型多樣，具有廣泛的藥理活性。有研究者以生物堿母核的差異以及化合物自身的極性差異(有無酚羥基)區(qū)別蓮子心中酚性和非酚性生物堿[2]。目前對(duì)于蓮子心的抗氧化作用主要集中在蓮子心的粗提物上，較少關(guān)注酚性生物堿的抗氧化活性，非酚性生物堿則幾乎被忽視。本研究旨在針對(duì)蓮子心中酚性生物堿(phenolic alkaloids，PA)和非酚性生物堿(nonphenolic alkaloids，NPA)，多指標(biāo)評(píng)價(jià)兩者的體外抗氧化活性，以期為進(jìn)一步研究蓮子心中總生物堿(total alkaloids，TA)的抗氧化性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要化學(xué)試劑 蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品(批號(hào)：20140319，含量>98.0%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丁羥甲苯(butylated hydoxytoluene，BHT，CAS-NO：128-37-0，含量>99.0%)，硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA，CAS-NO：504-17-6)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)-二銨鹽[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diamm- onium salt，ABTS，CAS-NO：30931-67-0]，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，CAS-NO：1898-66-4)，β-胡蘿卜素(CAS-NO：7235-40-7)，購(gòu)于Sigma公司；30%過氧化氫(批號(hào)：20131101)，鐵氰化鉀(potassium ferricyanide，K3[Fe(CN)6]，批號(hào)：20121213)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris-HCl，批號(hào)：20130710)，氯化亞鐵(批號(hào)：20130205)，焦性沒食子酸(批號(hào)：20131018)，三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA，批號(hào)：20131012)，2-脫氧核糖(2-deoxyribose，批號(hào)：20130814)，抗壞血酸(批號(hào)：20130121，含量：99.7%)，乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na，批號(hào)：20121112)，亞油酸(批號(hào)：20130406)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS，批號(hào)：20140607)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 植物材料 蓮子心，購(gòu)于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，產(chǎn)地為湖北洪湖，批號(hào)：20140101，經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部張洪教授鑒定為睡蓮科蓮(NelumbonuciferaGaertn.)成熟種子的綠色胚芽。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 SK5200H型超聲波清洗器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)，RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，HHS型精密恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，XW-80A型漩渦混合器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，YXJ-1型高速離心機(jī)(深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4 蓮子心中TA的制備 蓮子心磨成粗粉(100 g)，置1 000 mL燒杯中加入75%乙醇(固液比1：3)，封口超聲提取3次，每次1 h，過濾之后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，浸膏溶液加1%鹽酸調(diào)至pH值1～2，濾過，濾液用1%氨水調(diào)至pH值9～10，用等體積的三氯甲烷萃取兩次，分液合并三氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，濾過，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收三氯甲烷得浸膏，用1%鹽酸溶解后轉(zhuǎn)移到燒杯中，1%氨水調(diào)至pH值9～10析出沉淀，加水至300 mL靜置，用砂芯漏斗過濾得沉淀，冷凍干燥得TA[3]。

1.5 蓮子心中PA的制備 將上述蓮心總堿取粉末用適量三氯甲烷溶解，再用等體積3%氫氧化鈉萃取兩次，合并氫氧化鈉層，用稀鹽酸沉淀，直至上清液滴稀鹽酸或稀氨水無沉淀析出。沉淀用砂芯漏斗濾過，冷凍干燥，即得酚性生物堿[4]。

1.6 蓮子心中NPA的制備 將“1.5”項(xiàng)下中三氯甲烷層合并，旋蒸回收三氯甲烷，得到浸膏，將浸膏用pH值1～2的鹽酸溶液溶解，滴入氨水，出現(xiàn)淺黃色沉淀，至沉淀不再增加，過濾棄其濾液，沉淀干燥，即為非酚性生物堿[5]。

1.7 蓮子心中TA、PA和NPA含量測(cè)定 取蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品5 mg，精密稱定，無水乙醇溶解并定容至25 mL，得濃度為200 μg·mL-1蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液。分別從上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL置于7支10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，震蕩搖勻。靜置10 min后，于282 nm處測(cè)量吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取上述TA，PA，NPA干燥粉末各10 mg，無水乙醇溶解，并定容至250 mL。重復(fù)上述步驟，于282 nm處測(cè)定吸光度，每組樣品平行測(cè)3組[6]。

1.8 PA和NPA體外抗氧化活性比較

1.8.1 DPPH自由基清除測(cè)試 一定濃度范圍(2.70～48.65 μg·mL-1，無水乙醇溶解)的蓮子心TA，PA，NPA各取0.3 mL分別加入2.7 mL，0.2 mmol·L-1的DPPH(用無水乙醇溶解)，渦旋混勻，將配好的樣品避光靜置1 h后在517 nm處測(cè)其吸光度。以1 mL無水乙醇代替提取物作為空白對(duì)照，同樣濃度范圍的BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白對(duì)照DPPH的吸光度，As表示待測(cè)樣品DPPH吸光度[7]。

1.8.2 ABTS自由基清除試驗(yàn) 7 mmol·L-1ABTS與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀以9：1比例混合室溫下靜置16 h，使用前稀釋八倍作為ABTS儲(chǔ)備液。一系列濃度范圍(1.43～25.70 μg·mL-1，無水乙醇溶解)的蓮子心TA，PA，NPA(1.0 mL)中分別加入2.5 mLABTS儲(chǔ)備液，混勻后避光反應(yīng)20 min并于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值。以1 mL雙蒸水加ABTS待用混合液作為空白對(duì)照，BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白對(duì)照ABTS的吸光度，As表示待測(cè)樣品ABTS吸光度[8]。

1.8.3 羥基自由基清除 反應(yīng)體系中分別加入10 mmol·L-1的2-脫氧核糖400 μL、氯化鐵(10 mmol·L-1)100 μL、EDTA-2Na(1 mmol·L-1)100 μL、30%過氧化氫(10 mmol·L-1)100 μL、3種生物堿(10～100 μg·mL-1) 100 μL，再加入抗壞血酸(1 mmol·L-1)200 μL引發(fā)反應(yīng)，在37 ℃下反應(yīng)1 h，加入0.5%TBA的氫氧化鈉(0.025 mol·L-1)溶液1 mL和30%TCA水溶液1 mL，混合物80 ℃水浴加熱30 min，冷卻。在532 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)s，以0.05 mol·L-1PBS(pH值7.4)在反應(yīng)體系中代替樣品作為空白對(duì)照測(cè)得吸光值A(chǔ)Ⅰ，計(jì)算清除率，同濃度范圍的BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。羥基清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白對(duì)照的吸光度，As表示待測(cè)樣品吸光度[9]。

1.8.4 超氧陰離子自由基清除 200 μg·mL-1待測(cè)樣品1 mL加入Tris-HCl緩沖液(pH值8.2，0.05 mol·L-1)4.5 mL在25 ℃下反應(yīng)10 min加入0.003 mol·L-1鄰苯三酚(10 mmol·L-1鹽酸溶解)600 μL，充分反應(yīng)后立即在波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光度，每隔30 s測(cè)定一次吸光度，直至吸光值不再發(fā)生明顯變化，用10 mmol·L-1鹽酸代替樣品作為空白對(duì)照，BHT作陽(yáng)性對(duì)照。鄰苯三酚的自氧化速率可以根據(jù)吸光度-時(shí)間曲線計(jì)算斜率[10]。

1.8.5 還原能力測(cè)試 各取TA，PA，NPA20 mg配制成400 μg·mL-1，樣品溶液，分別取50，125，200，250，300，350，400，450，500 μL樣品，加雙蒸水至1 mL，分別加0.2 mol·L-1PBS(pH值=6.6)和1%K3[Fe(CN)6]各2.5 mL，在50 ℃下反應(yīng)20 min，再加入10%TCA 2.5 mL，3 000 r·min-1(r=3 cm)離心10 min，取上清液2.5 mL加入雙蒸水2.5 mL，加入0.1%氯化鐵0.5 mL混合，10 min后在700 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)s，以不加樣品的雙蒸水同法操作作為空白對(duì)照測(cè)得吸光值，增加的吸光度表示還原能力的增加[11]。

1.8.6 β-胡蘿卜素漂白測(cè)試 精密稱取β-胡蘿卜素6 mg溶解于三氯甲烷20 mL中，取上述β-胡蘿卜素溶液4 mL，亞油酸80 mg、聚山梨酯80 800 mg混合于500 mL的圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷，后加入雙蒸水200 mL，旋轉(zhuǎn)得乳化液。取上述乳化液3.0 mL分別加入到含有0.2 mL，500 mg·mL-1的TA，PA，NPA的試管中，50 ℃熱水浴下孵育2 h。在470 nm處檢測(cè)吸光度值，每隔30 min檢測(cè)一次，測(cè)2 h。BHT作為陽(yáng)性對(duì)照[12]。脂質(zhì)抑制率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中AⅠ表示0 min時(shí)的吸光度，As表示孵育2 h時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 樣品中PA和NPA的含量 采用紫外分光光度法檢測(cè)蓮子心中TA、PA、NPA含量，蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品在20～80 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性范圍，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.013 9C-0.033 9，(R2=0.999 9)。測(cè)得每100 g蓮子心粗粉中可制得TA 0.91 g，每100 g TA中可分離得到PA 87 g，NPA 11 g。

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除作用 BHT、TA、PA和NPA在2.70～48.65 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，且呈劑量依賴性，見圖1A，IC50值見表1。

2.2.2 ABTS自由基清除作用 在1.43～25.70 μg·mL-1范圍內(nèi)，BHT，TA，PA和NPA表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS自由基清除作用，見圖1B，IC50值見表1。

2.2.3 羥基自由基清除 BHT，TA，PA和NPA在0.07～0.33 μg·mL-1范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除作用見圖1C，IC50值見表1。

2.2.4 超氧陰離子清除作用 200 μg·mL-1BHT，TA，PA和NPA對(duì)超氧陰離子自氧化的抑制作用見圖2，4種藥物作用于鄰苯三酚體系其自氧化速率見表1。

A.DPPH自由基；B.ABTS自由基；C.羥基自由基

表1 BHT、TA、PA、NPA對(duì)自由基半數(shù)清除濃度(IC50)

Tab.1 IC50values of BHT，TA，PA，NPA on free radicals

藥物IC50/(μg·mL-1)DPPHABTS·OHβ?胡蘿卜素脂質(zhì)抑制率/%超氧陰離子Kb(×10-4)BHT8．853．910．0144．379．19TA21．8914．250．0389．638．72PA27．1020．550．0385．855．87NPA32．8725．940．0883．786．68

圖2 BHT、TA、PA、NPA對(duì)超氧陰離子清除作用(n=3)

Fig.2 Clearance of BHT, TA, PA, and NPA on superoxide anion radicals(n=3)

2.2.5 總還原力測(cè)定 BHT、TA、PA和NPA還原性測(cè)定見圖3，4種樣品還原力均隨濃度升高而增加。

圖3 BHT、TA、PA、NPA總還原力測(cè)定(n=3)

Fig.3 Detection on reducing power of BHT, TA, PA, and NPA(n=3)

2.2.6 β-胡蘿卜素漂白測(cè)試 β-胡蘿卜素漂白測(cè)試的結(jié)果見圖4，4種樣品對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率見表1。

3 討論

DPPH和ABTS是兩種相對(duì)穩(wěn)定的自由基化合物，最常用于抗氧化活性評(píng)價(jià)。在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)及ABTS自由基清除活性中，根據(jù)圖1A，1B 結(jié)果均可明顯發(fā)現(xiàn)蓮子心中生物堿(TA，PA，NPA)對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除具有劑量依賴性，且隨樣品濃度增大，抑制率增加。

圖4 BHT、TA、PA、NPA對(duì)β-胡蘿卜素漂白測(cè)試影響(n=3)

Fig.4 β-carotenoid bleaching assay of BHT, TA, PA, and NPA(n=3)

本研究采用Fe3+-EDTA-抗壞血酸-過氧化氫體系產(chǎn)生羥基自由基，脫氧核糖受羥基自由基進(jìn)攻后裂解，在酸性、加熱的條件下與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色化合物，抗氧化劑的存在可阻止羥基自由基攻擊脫氧核糖[13]。根據(jù)圖1C和表1結(jié)果，非酚性生物堿對(duì)羥基自由基的抑制率最弱，總生物堿與酚性生物堿相近并稍弱于BHT。

超氧陰離子是體內(nèi)最常見的自由基之一。焦性沒食子酸在堿性環(huán)境中自發(fā)產(chǎn)生超氧陰離子，其自氧化的速率與超氧陰離子的濃度相關(guān)。待測(cè)物可清除超氧陰離子能力而減緩焦性沒食子酸自氧化的速率。根據(jù)表1中Kb值，對(duì)于抑制焦性沒食子酸自氧化的速率依次為BHT>TA>NPA>PA。

本研究采用鐵還原抗氧化能力法測(cè)定生物堿的總還原能力，在酸性環(huán)境下，F(xiàn)e3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)可被抗氧化劑還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593 nm 處有最大吸收，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)[14]。蓮子心中生物堿由于其本身強(qiáng)的還原性與Fe3+競(jìng)爭(zhēng)，抑制Fe3+被氧化，從圖3中可看出在相同濃度下，TA還原性最強(qiáng)，其次為PA，最弱為NPA，且均弱于BHT，此結(jié)果與對(duì)自由基抑制率活性一致。

脂質(zhì)過氧化是另一類對(duì)生命有機(jī)體產(chǎn)生重大影響的氧化作用。不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化損傷將影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，可導(dǎo)致多種疾病及機(jī)體衰老。本研究采用β-胡蘿卜素漂白模型對(duì)生物堿的抗脂質(zhì)過氧化比較。結(jié)果表明，蓮子心中生物堿對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸脂質(zhì)過氧化體系有良好的抑制作用，在相同劑量下，生物堿的抑制作用均強(qiáng)于對(duì)照BHT，抑制效果最佳為TA，PA和NPA差距不大。

綜上所述，蓮子心生物堿中酚性生物堿的抗氧化活性強(qiáng)于非酚性生物堿。從而表明蓮子心酚性生物堿在體外抗氧化活性研究中具有一定的開發(fā)潛力。

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《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部

Comparison of Antioxidant Activity Between Phenolic and Nonphenolic Alkaloids in Nelumbo Nucifera Gaertn in vitro

YANG Xiaoqing1, SONG Jinchun1, XIE Shunlan2, HAO Haohua1

(1.DepartmentofPharmacy,RenmingHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China； 2.PharmaceuticalCollege,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)

Objective To compare the antioxidant activity between phenolic and nonphenolic alkaloids inNelumboNuciferaGaertn.invitro. Methods DPPH, ABTS, hydroxyl radical scavenging, super oxygen anion from oxidation, reducing power and beta carotene bleaching test methods were used to evaluate the antioxidant activity of the alkaloids. Results Half maximalinhibitory concentration (IC50) of DPPH among total alkaloid, phenolic alkaloids and nonphenolic alkaloids was 21.89, 27.10 and 32.87 μg·mL-1, respectively； IC50of ABTS free radicals was 14.25, 20.55, 25.94 μg·mL-1； The hydroxyl radical scavenging IC50was 0.03, 0.03, 0.08 μg·mL-1； The auto-oxidation rate of super oxygen was 8.72×10-4, 5.87×10-4, 6.68×10-4； The total alkaloid had the best reducing power, while the non-phennolic alakloids had the worst； Lipid inhibition rate of three alkaloids were 89.63%, 85.85% and 83.78% respectively. Conclusion Phenolic alkaloids are better than non-phenolic alkaloids in hydroxyl radical scavenging, reducing power and anti-lipid peroxidation, resulting in a promising prospect.

NelumbonuciferaGaertn.； Phenolic alkaloids； Nonphenolic alkaloids； Antioxidant activity；invitro

2014-12-01

2015-03-06

楊小青(1990-)，女，湖北宜昌人，在讀碩士，研究方向：臨床藥學(xué)。電話：(0)15271919075，E-mail：yangxiaoqing9075@163.com。

宋金春(1964-)，男，湖北孝感人，教授，主任藥師，博士，研究方向：臨床藥學(xué)。電話：027-88047471，E-mail：songjc1234@126.com。

R285.5

A

1004-0781(2015)12-1579-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.008