巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)產(chǎn)聚乳酸降解酶條件的研究

崔 婧 ，翟麗華,時東方，陳 珊

(1.長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032；2.長春市第48中學，吉林長春130051；3.東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024)

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)產(chǎn)聚乳酸降解酶條件的研究

崔 婧1,3，翟麗華2,時東方1，陳 珊3

(1.長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032；2.長春市第48中學，吉林長春130051；3.東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024)

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)具有降解聚乳酸的能力。對該菌的產(chǎn)PLA降解酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)聚乳酸降解酶的最佳條件為：產(chǎn)酶誘導物為酵母粉，培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)基初始pH為8.0，發(fā)酵溫度為40℃，搖床轉(zhuǎn)速為175r·min-1，接種量為5%(V/V)。

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)； PLA降解酶；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

聚乳酸(PLA)是以乳酸為原料聚合而成，可用植物中的淀粉來進行生產(chǎn)，而不消耗石油資源。PLA制品在土壤中最終被降解為CO2和H2O，降低環(huán)境污染，減少溫室效應。PLA除了具有可生物降解性和植物來源性這兩大特點外，還具有較好的機械性能、生物相容性和易于加工的特性，因此近年來得到了研究者的廣泛關(guān)注，被認為是可以代替常規(guī)塑料的新型“生態(tài)材料”之一[1-4]。

雖然PLA與PHB、PCL及PBS等其它聚酯類材料相比在性能上具有明顯的優(yōu)勢，但PLA的自然降解速率較為緩慢，目前發(fā)現(xiàn)能夠降解PLA的微生物和降解酶也比較少[5-6]，不到0.04%[7-9]。因此，只有深入了解PLA生物降解的機理，加快PLA的生物降解，才能夠真正實現(xiàn)PLA的利用。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：(NH4)2SO41g·L-1，酵母提取物 0.25 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.02 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g·L-1，MnSO40.5mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1，Na2WO40.5mg·L-1，pH為8.0。

1.2 PLA降解酶活力的測定方法

按照乳酸試劑盒(南京建成)，將50μL樣品與500μL酶工作液混勻，再加入100μL顯示劑，在37℃下共同作用1h，最后加入1000μL終止液，在530nm下測定吸光度值。通過上清液中乳酸的生成量來表征PLA降解酶活力。

1.3 誘導物對菌株產(chǎn)酶的影響

在基本培養(yǎng)基中分別加入明膠、酵母、酪蛋白、酪氨酸、蛋白胨、PLA 等不同誘導物，濃度為0.3%。發(fā)酵培養(yǎng)24h后取樣，測定在不同誘導物作用下聚乳酸降解酶活力，比較不同誘導物的誘導作用。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在確定發(fā)酵最佳誘導物后，對該菌的產(chǎn)PLA降解酶活力最高的發(fā)酵時間、初始pH值、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等條件進行優(yōu)化，獲得最適的產(chǎn)酶條件。

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1.4.1 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

以酵母粉為誘導物，液體振蕩培養(yǎng)，每隔12h取樣，分別測定酶活力。

1.4.2 發(fā)酵初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的酵母液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)36h，然后取樣測酶活力。

1.4.3 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵溫度設(shè)定為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，搖床培養(yǎng)36h，測定酶活力。

1.4.4 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響

1.4.5 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

在100ml培養(yǎng)基中，分別接種2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml，在40℃下振蕩培養(yǎng)36h，取樣測定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導物對菌株產(chǎn)酶的影響

據(jù)文獻報道， PLA降解酶可能屬于蛋白酶類，因此用蛋白類物質(zhì)對Bacillusmegaterium產(chǎn)PLA降解酶的過程進行誘導，結(jié)果如圖1所示。Bacillusmegaterium分泌的PLA 降解酶確實受蛋白類物質(zhì)的誘導，其中酵母粉顯著提高酶活力，因此將酵母粉定為發(fā)酵產(chǎn)PLA降解酶的最佳誘導物。

圖1 誘導物對菌株產(chǎn)酶的影響

2.2 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

在基本培養(yǎng)基中加入酵母粉作為誘導物，在發(fā)酵的第12h、36h、48h、60h、72h取樣，測定酶活力，如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的增長，酶活力逐漸升高，這是因為隨著時間延長，菌體數(shù)量增多，產(chǎn)酶增加，在第36h酶活力最高。在36h后，隨著時間延長，酶活力逐漸降低，菌體生長進入衰退期，因此把發(fā)酵時間定為36h。

圖2 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3 發(fā)酵初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

在初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的條件下培養(yǎng)，發(fā)酵36h后取樣，測定酶活力。結(jié)果如圖3所示，發(fā)酵初始pH值對菌株產(chǎn)PLA降解酶影響比較明顯。當起始pH值小于8.0時，酶活力逐漸降低；pH值為8.0時，酶活力較高；pH值為9.0時，酶活力最高，這可能是因為在堿性條件下聚乳酸自身發(fā)生降解。因此選pH為8.0為最適產(chǎn)酶初始pH值。

圖3 發(fā)酵初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

2.4 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)36h后取樣，測定在不同溫度下發(fā)酵產(chǎn)PLA降解酶活力。結(jié)果如圖4所示，溫度在40℃時，酶活力最高；在40～45℃之間，隨著溫度升高酶活力下降；但在50℃時，酶活力再次升高，這可能是因為高溫偏堿條件下聚乳酸自身發(fā)生降解。所以培養(yǎng)溫度不宜過高，選擇最適發(fā)酵溫度為40℃。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)生聚乳酸解聚酶酶活力的影響

2.5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響

在100r·min-1、125 r·min-1、150 r·min-1、 175 r·min-1、200 r·min-1條件下分別培養(yǎng)，36h后取樣測酶活力。結(jié)果如圖5所示，當搖床轉(zhuǎn)速低于175 r·min-1時，酶活力隨轉(zhuǎn)速下降而逐漸降低，因為通氧量比較低；當搖床轉(zhuǎn)速大于175 r·min-1時，隨搖床轉(zhuǎn)速的提高，酶活力也逐漸下降。因此發(fā)酵的最佳搖床轉(zhuǎn)數(shù)為175 r·min-1。

圖5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響

2.6 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

接種量分別為2%、4%、5%、6%、8%、10%，發(fā)酵36h取樣，測定酶活力。由圖6可知，隨著接種量升高，酶活力逐漸升高，當接種量達到5%時，酶活力最高；繼續(xù)提高接種量酶活反而降低，因此發(fā)酵時最佳接種量為5%。

圖6 接種量對菌株產(chǎn)生聚乳酸解聚酶酶活力的影響

3 結(jié)論

Bacillusmegaterium具有降解聚乳酸的能力。據(jù)文獻報道，很多聚乳酸降解酶屬于蛋白酶類。本文以明膠、蛋白胨、酪氨酸、酪蛋白、酵母粉等蛋白類物質(zhì)作為誘導物，發(fā)現(xiàn)Bacillusmegaterium產(chǎn)PLA降解酶活力都有提高，這其中以加入酵母粉后產(chǎn)PLA降解酶活力最高，由此推斷該產(chǎn)的PLA降解酶可能屬于蛋白酶類，最適誘導物為酵母粉。

用液體振蕩培養(yǎng)法，優(yōu)化Bacillusmegaterium菌產(chǎn)PLA降解酶的發(fā)酵條件，結(jié)果顯示：菌株產(chǎn)酶的最適發(fā)酵時間為36h，培養(yǎng)基起始pH為8.0，產(chǎn)酶最適溫度為40℃，最適搖床轉(zhuǎn)速為175 r·min-1，接種量為5%(V/V)。這為進一步研究PLA降解酶的分離純化奠定了基礎(chǔ)。

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2015-07-25

崔 婧(1986- )，女，吉林長春人，長春師范大學中心實驗室助理實驗師，碩士，從事生物化學與分子生物學研究。

陳 珊(1956- )，女，吉林長春人，教授，博士，碩士生導師，從事環(huán)境微生物研究。

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2095-7602(2015)12-0050-04