莊河大骨雞生長激素受體基因內含子2多態(tài)性的研究

謝明欣，許 紅，畢 雪，朱弘焱，蘇玉虹，田玉民

（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001）

莊河大骨雞生長激素受體基因內含子2多態(tài)性的研究

謝明欣，許 紅，畢 雪，朱弘焱，蘇玉虹，田玉民?

（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001）

為研究莊河大骨雞生長激素受體（GHR）基因內含子2特點，本試驗從200只大骨雞血液中提取DNA，PCR擴增GHR內含子2后進行HindⅢ酶切和瓊脂糖凝膠電泳。研究結果表明，所選取的200只莊河大骨雞GHR基因內含子2片段均能得到PCR擴增，產物大小為914 bp；擴增產物中具有2個HindⅢ酶切位點，均能獲得3個酶切片段（529 bp、247 bp和138 bp），因此該酶切位點上無遺傳多態(tài)性。

莊河大骨雞；GHR基因；內含子2；內切酶H indⅢ

莊河大骨雞主產于大連莊河市，是在特殊歷史時期及特定的地理和氣候條件下孕育出的獨特地方品種。大骨雞具有耐粗飼、耐寒及適應力強的特點，以體型大、胸深寬廣、背寬而長、腿高粗壯、腹部豐滿著稱；所產雞蛋具有蛋大殼紅、營養(yǎng)豐富、味道鮮美的特色。隨著大骨雞消費市場的擴大，產業(yè)化進程加快，市場需求量日益增加。然而，與引進的專門化品種/品系相比，對其研究甚少，制約了產業(yè)化發(fā)展。雖然大骨雞群體的生長速度較慢、飼料轉化率較低，兼具產肉和產蛋性能但其中仍有相當?shù)膫€體具有較高的生產性能。因此，研究大骨雞遺傳特點，對了解和開發(fā)大骨雞具有重要意義。

據(jù)文獻報道，影響雞生長性狀主要有生長激素及生長激素受體。生長激素（growth hormone,GH是影響動物3大物質代謝和生長發(fā)育的重要激素其發(fā)揮作用時必須要與細胞膜表面的受體結合即生長激素受體（growth hormone receptorGHR），然后通過細胞內的信號轉導途徑引起生理反應。GHR與促乳素受體、促紅細胞生成素受體、白細胞介素受體屬于同一家族，其結構特點是受體胞外的200多氨基酸具有顯著的同源性，信號途徑亦相似。雞GHR基因的cDNA最早是由Burnside等[1]克隆和測序，發(fā)現(xiàn)GHR的cDNA全長為13 kb，具有9個外顯子（缺少人類的外顯子3），以單拷貝形式存在，共編碼608個氨基酸（包括16個氨基酸的信號肽），與哺乳動物核苷酸序列同源性較低，為50%～58%。研究表明，GHR翻譯的起始點位于內含子2上，內含子2的多態(tài)性與生長速度、產蛋量和產雙黃蛋量有關。鑒于以往研究發(fā)現(xiàn)莊河大骨雞GHR內含子2存在HindⅢ酶切位點，因此，本研究擬在獲得產蛋數(shù)據(jù)基礎上，通過分析莊河大骨雞GHR基因片段特點，揭示GHR基因多態(tài)性與產蛋性能的相關性，為育種和遺傳學研究提供參考和借鑒。凈工作臺、高速冷凍離心機、恒溫水浴箱、PCR擴增儀、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、超純水系統(tǒng)、-70℃超低溫冰箱、微波爐等。

1.3 試驗方法

1.3.1 大骨雞血液基因組DNA提取及質量檢測 取大骨雞靜脈血1 mL，用裂解液、蛋白酶K和SDS進行細胞裂解，用酚、氯仿和異戊醇提取基因組DNA。將提取的大骨雞基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測DNA質量。

1.3.2 GHR PCR擴增的引物設計 根據(jù)NCBI雞GHR基因序列，選擇內含子2為擴增靶片段，利用軟件PRIMER 5.0設計引物如下：上游引物(F)：5'agt tctatcagtaggcagtaa 3'下游引物(R)：5'at tcaatctatgctcct tcacaaaa 3'

根據(jù)GHR基因序列，利用Primer 5.0分析可知上述擴增片段內含有內切酶HindⅢ酶切位點。

1.3.3 大骨雞GRH基因片段PCR擴增 PCR擴增的反應體系如表1。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，51.8℃退火45 s，72℃延伸45 s；30～35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min用1%的瓊脂糖凝膠進行PCR產物電泳，DNA分子量標準品是Marker 2000，紫外燈下觀察并照相。

1.3.4 PCR擴增產物的酶切 限制性內切酶HindⅢ的酶切反應體系如表2。酶切條件為37℃，3～4 h。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選用遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院科研團隊養(yǎng)殖的莊河大骨雞，隨機挑選200只健康雌雞單籠飼養(yǎng)于同一雞舍，管理條件完全相同，日糧參照美國NRC營養(yǎng)標準。

1.2 試驗儀器與試劑 蛋白酶K、瓊脂糖、DL2000 Marker限制性內切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均購自大連寶生物工程有限公司；其他均為分析純試劑。試驗儀器均為國產或進口設備，如超

表1 大骨雞GRH基因內含子2 PCR擴增反應體系Tab le1 PCR reaction system for GHR intron 2 of Zhuanghe Dagu chicken

1.3.5 PCR產物酶切后電泳 用1%的瓊脂糖凝膠進行酶切產物的電泳，DNA分子量標準品是Marker 2000，紫外燈下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 大骨雞血液基因組DNA質量檢測 大骨雞血液DNA瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖1 大骨雞血液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA for blood samp les of Zhuanghe Dagu chicken

圖1可見大分子量的DNA條帶，為基因組DNA。

2.2 大骨雞GHR基因內含子2 PCR擴增結果 采用作者設計的引物，PCR擴增大骨雞GHR基因內含子2的部分片段，其瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。

圖2 大骨雞GRH基因內含子2 PCR產物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR of GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

由圖2可見，PCR產物大小約為910 bp，符合預期的擴增長度，可以用來進行RFLP分析。

2.3 PCR產物HindⅢ酶切結果 本試驗所設計的PCR上下游引物間的具有兩個HindⅢ酶切位點，因此，大骨雞GRH基因內含子2 PCR產物酶切后電泳結果見圖3，條帶大小為529 bp、247 bp和138 bp。在本試驗所檢測的200個體中僅出現(xiàn)上述一種帶型，所以本試驗所采樣的大骨雞GHR基因內含子2片段沒有多態(tài)性。

3 討論與結論

研究表明，GHR基因多態(tài)性與來航雞的早期體重、蛋雞開產至273日齡產蛋量相關[2]。Hocking等[3]研究發(fā)現(xiàn)GHR作為候選基因與雞產蛋性能、雙黃蛋數(shù)有關，Kuhnlein等[4]報道了GHR基因多態(tài)性與雞產蛋數(shù)相關。而Nagaraja等[5]的研究結果進一步驗證了 GHR基因與雞產蛋數(shù)相關。國內的葛洪偉等[6]在文昌雞GHR基因內含子2發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性，并證實該多態(tài)性與產蛋性狀中的雙黃蛋產量呈顯著相關。徐文娟等[7]在文昌雞GHR基因內含子5中檢測到多態(tài)性并證明其多態(tài)性與蛋殼厚度顯著相關。裴勤賢[8]對興義矮腳雞公雞進行GHR基因內含子2研究發(fā)現(xiàn)，其多態(tài)性與公雞各周齡體重相關顯著，與母雞體重相關不顯著。此外，王洪才等[9]發(fā)現(xiàn)GHR基因內含子2序列存在較豐富的多態(tài)性，其多態(tài)性對莊河大骨雞的產肉性能存在一定的影響。國內其他學者對GHR基因與生長性能之間的關系及遺傳多樣性也做了一些研究[10-11]。

本試驗所擴增的是GHR基因內含子2的部分片段，在200余只莊河大骨雞中僅檢測到一種Hind III酶切類型，即2個酶切位點3個片段，沒有出現(xiàn)該位點的多態(tài)性。雖然國內其他學者的研究中存在GHR多態(tài)性[9]，可能的原因有：①確實不存在多態(tài)性；②多態(tài)性基因型頻率低，受200只母雞樣本的限制，未檢測到多態(tài)性個體；③所擴增的GHR基因片段不同，導致結果不同。為更確切探明莊河大骨雞GHR基因內含子2是否存在多態(tài)性位點，項目組擬進一步測序分析。

GHR作為影響動物體生長的關鍵成分，GHR基因結構變異可能導致蛋白結構和功能的改變，進而影響與GH的結合，導致生長速度降低。自1992年以來，已有較多的關于雞GHR結構、多態(tài)性和功能的研究，但還有很多功能尚不清楚，如多態(tài)性與功能的關系、細胞內信號傳遞機制等。因此，需要圍繞雞的GHR進行深入地研究，以便為調控家禽生長性能、產蛋性能的分子標記輔助選擇奠定基礎。

圖3 大骨雞GRH基因內含子2 PCR產物酶切后凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of enzym e digestion for PCR p roducts o f GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

[1]Burnside J,Liou S S,Zhong C,et al.Abnormal growth hormone receptor gene expression in the Sex-l inked dwar f chicken[J].Endocrinol,1992,88(1):20-28.

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Study on Polymorphism Grow th Hormone Receptor intron 2 in Zhuanghe Dagu Chicken

Xie Mingxin,Xu Hong,Bi Xue,Zhu Hongyan,Su Yuhong,Tian Yumin*
（Col lege of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001）

In order to study the characteristics of growth hormone receptor(GHR)int ron 2 for Zhuanghe Dagu chicken,DNA were ext racted f rom 200 blood samples of Zhuanghe Dagu chicken and ampl ifed by PCR with primers of GHR int ron 2.The PCR products were digested with enzyme HindⅢand then displayed by agarose gel elect rophoresis.The resul ts showed that al l GHR int ron 2 in 200 samples were ampl i fed by PCR with products of 914 bp.Al l samples showed two enzyme sites of HindⅢ among the product and three f ragments of 529 bp,247 bp and 138 bp in agarose gel.Therefore,there was no Genetic polymorphism.

Zhuanghe Dagu chicken;GHR gene;Intron 2;Enzyme HindⅢ

S831

1672-9692(2015)05-0034-04

2015-04-05

謝明欣（1992-），女，動物科學專業(yè)在讀。

田玉民（1962-），男，教授，碩士生導師，研究方向為飼料資源開發(fā)與利用。

遼寧省大學生創(chuàng)新課題（201410160016）、遼寧省科技廳計劃項目（2014209006）及遼寧醫(yī)學院領軍人物資助項目