H 3亞型鴨源流感病毒分離鑒定及HA基因序列分析

李巖

（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 青岡 151600）

H 3亞型鴨源流感病毒分離鑒定及HA基因序列分析

李巖

（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 青岡 151600）

為了研究H 3亞型禽流感病毒的分子特征，本研究從鴨的糞便樣本中分離到一株禽流感病毒，通過血凝抑制試驗證實該分離株為H3亞型流感病毒，命名為A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N 2)。對其血凝素基因進(jìn)行了克隆和序列分析，結(jié)果表明分離株與韓國水鳥的H3N 2亞型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高，達(dá)到94.6%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析進(jìn)一步證實分離株可能來源于韓國的水鳥。本研究為H 3亞型禽流感的流行病學(xué)研究補(bǔ)充了新的數(shù)據(jù)。

鴨；流感病毒；H 3亞型；HA基因；序列分析

禽流感（Avian inf luenza,AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒（Avian inf luenza virus,AIV）所引起的禽類傳染病。該病廣泛流行于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)乃至人類造成了巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)AIV的血凝素（Hemagglutinin,HA）和神經(jīng)氨酸酶可將其分為16個HA亞型和9個NA亞型[1]。目前，我國禽群中常見的亞型主要有H3、H5、H6、和H9[2-3]，其中H5為高致病性亞型，其他亞型均為低致病性禽流感病毒。水禽是流感病毒的自然宿主和基因儲存庫，水禽在流感病毒的進(jìn)化中發(fā)揮重要作用。H3亞型流感病毒感染的宿主譜比較廣泛，包括禽、豬、人、犬馬、貓等[4-8]。1989年，我國馬群中暴發(fā)禽源H3N亞型流感病毒，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。自2006年以來，韓國和中國等地頻繁發(fā)生禽源H3N2亞型流感病毒感染犬的事件[8-9]。這些證據(jù)表明，雖然H3亞型AIV在禽中為低致病性的，但跨種傳播后感染性增強(qiáng)，危害嚴(yán)重。因此，有必要加強(qiáng)H3亞型AIV的流行病學(xué)調(diào)查。本研究中，筆者在進(jìn)行常規(guī)的流行病學(xué)調(diào)查時從臨床健康鴨中分離到一株H3N2亞型AIV，并對其HA基因進(jìn)行了序列分析，報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和拭子 AMV Reverse Transcriptase、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs等購自大連寶生物工程公司；Trizol Reagent、RNase Inhibitor購自Invit rogen公司；AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。流感病毒H3、H5、H9和雞新城疫（Newcast le disease, ND）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。鴨泄殖腔棉拭子采自黑龍江省青岡縣某養(yǎng)殖戶的家鴨。

1.2 病毒分離及亞型鑒定 鴨泄殖腔棉拭子液按常規(guī)方法處理，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵化48 h后，收集雞胚尿囊液，測定血凝價，將具有血凝價的雞胚尿囊液先與ND標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）試驗，ND HI試驗陰性的雞胚尿囊液再與AIV H3、H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行HI試驗，具體操作程序與判斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。將鑒定為陽性的病毒分裝，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中H3亞型AIV HA基因的核苷酸序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄引物序列Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因特異性PCR引物序列：HA-F:5’-AGCAAAAGCAGGGGATACCTGC-3’，HA-R:5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTGTAATTATC-3’。

1.4 病毒提取及cDNA的制備 參考AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒說明書提取尿囊液中病毒RNA。然后參考AMV Reverse Transcriptase說明書，用Uni12反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA[11]。

1.5 HA基因擴(kuò)增及序列分析 以上述制備的cDN為模板，用HA基因特異性引物HA-F和HA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]，隨后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。產(chǎn)物純化后連接pMD-18T載體，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。下載H3亞型AIV參考毒株HA基因序列，用DNAStar程序中的MegAl ign軟件進(jìn)行同源性比對用MEGA 5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 病毒的分離及鑒定 病料接種雞胚后收集的尿囊液能夠凝集雞紅細(xì)胞，血凝價能夠達(dá)到29ND、H5和H9 AI陽性血清均不能夠?qū)υ撃蚰乙寒a(chǎn)生抑制作用，而H3亞型AI標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能夠產(chǎn)生很高的抑制作用，血凝抑制效價達(dá)到9log2，從而表明該尿囊液含有H3亞型AIV。命名為A/Duck/Hei longj iang/1/2014（H3N2）。

2.2 HA基因的PCR擴(kuò)增 用H3亞型AIV HA基因特異性引物對尿囊液中提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，可見在1 76 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。

圖1 HA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of HA gene

2.3 HA序列分析 測序結(jié)果表明，HA基因全長1 765 nt，編碼區(qū)長1 701 nt，位于30～1 730 nt共編碼566個氨基酸。對HA基因編碼區(qū)核酸序列分析表明，分離株A/Duck/Hei longjiang/1/2014（H3N2與參考株A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005（H3N2的同源性最高，為94.6%，而氨基酸序列同源性最高 的 毒 株 為 A/pigeon/Nanchang/9-058/2000（H3N3），達(dá)到97.3%。氨基酸序列進(jìn)一步分析表明HA蛋白共有6個潛在的N糖基化位點(diǎn)，分別為NNT（8位）、NGT（22位）、NAT（38位）、NVT（165位）、NGS（285位）和NGT（483位），與A/Duck/Ukraine/1/ 63(H3N8)比較，在81位缺少一個糖基化位點(diǎn)?？乖稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，與A/Duck/Ukraine/1963(H3N8相比，分離株的抗原決定簇A、B和C區(qū)的氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生一定程度的改變；受體結(jié)合位點(diǎn)226及228位均為Q和G[12]（見表1）。HA裂解位點(diǎn)均為PE KQTRGLF[13]。

表1 HA抗原及受體結(jié)合位點(diǎn)的差異比較Table1 Comparison of antigenic sites and receptor binding sites o f HA

2.4 HA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 根據(jù)分離株A/ Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2)的HA基因核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。結(jié)果表明，分離株與A/pigeon/Nanchang/9-058/2000(H3N3)親緣關(guān)系最近，與韓國株共處于同一進(jìn)化分支內(nèi)，與最早的禽源H3亞型AIV A/duck/Ukraine/1963(H3N8)處于不同的進(jìn)化分支。

3 討論

H3亞型AIV對禽來講雖然是低致病性的，但跨種傳播后常導(dǎo)致嚴(yán)重的危害。目前已有確鑿證據(jù)表明H3亞型AIV能夠跨越種間屏障感染豬、馬、犬和貓等多種哺乳動物[2-7]。本研究從無臨床癥狀的家鴨體內(nèi)分離到一株AIV，經(jīng)血凝試驗和血凝抑制試驗證實該分離株為一株H3亞型AIV。HA基因分析表明分離株與分離于韓國水鳥的H3N2亞型AIV A aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高，系統(tǒng)發(fā)育樹分析進(jìn)一步證實分離株可能來源于韓國的水鳥。同時，分析發(fā)現(xiàn)，分離株在多個抗原位點(diǎn)上與最早分離株A/Duck/Ukraine/1963(H3N8)均有明顯差異，表明其已經(jīng)發(fā)生明顯的抗原變異，以適應(yīng)環(huán)境和宿主的壓力。HA裂解位點(diǎn)為PEKQTRGLF，表明其是一株低致病性AIV。

圖2 HA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene

家鴨是流感的自然儲存宿主，多種亞型AIV在鴨中均能分離到，因此，家鴨在AI的流行中扮演重要角色。H3亞型AIV是家鴨中普遍存在的低致病性流感亞型，但其能夠為其他不同亞型流感病毒的重組提供基因片段[14]，可能導(dǎo)致新的具有高致病性毒株的出現(xiàn)，從而造成流感暴發(fā)，因此，開展H3亞型低致病性AIV的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的理論和實踐意義。

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Isolation，identification ofH3 subtype influenza virus originated from duck and analysis of HA gene

Li Yan
（Animalhusbandryandveter inarybureauofQinggang,Hei longj iang Qinggang 151600）

To investigate the molecular characteristics of H3 subtype avian inf luenza virus, the isolation of viruses f rom duck fecal samples was conducted.A H3 subtype avian inf luenza virus A/Duck/Hei longj iang/1/2014 (H3N2) was isolated and identif ied by hemagglutination inhibition tests.The hemagglutinin gene was cloned and analyzed.The resul ts showed that the isolation virus was closely related to the A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005 with the highest homology of 94.6%.Phylogenetic t ree analysis further conf irmed that the isolation virus may derive f rom water birds f rom South Korea.The present research has added new data for the H3 subtype of avian inf luenza epidemiological studies.

Duck;Inf luenza virus;H3 subtype;HA gene;Sequence analysis

S855.3

1672-9692(2015)05-0007-05

2015-02-25

李巖（1974-），男，本科，高級獸醫(yī)師，獸醫(yī)站長，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣和動物疾病診療工作。