DNA啟動(dòng)子甲基化致ADAMTS9蛋白下調(diào)促進(jìn)大腸癌病程進(jìn)展

王鳳，王睿，王衍晶

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011；

2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110024

DNA啟動(dòng)子甲基化致ADAMTS9蛋白下調(diào)促進(jìn)大腸癌病程進(jìn)展

王鳳1，王睿2，王衍晶1

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011；

2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110024

背景與目的：大腸癌的發(fā)病率逐年遞增。該研究旨在考察ADAMTS9蛋白水平及其啟動(dòng)子甲基化水平在大腸癌發(fā)病及病程進(jìn)展中的意義。方法：采用甲基化特異性PCR法，檢測(cè)162例大腸癌患者外周血來(lái)源DNA樣本中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平；并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)162例大腸癌患者和150例健康體檢者血漿ADAMTS9蛋白水平。結(jié)果：與健康人相比，大腸癌患者血漿中ADAMTS9蛋白水平明顯降低[(65.25±9.70)μg vs (50.28±9.66)μg，P＜0.001]；162例大腸癌患者中有66例ADAMTS9基因啟動(dòng)子存在甲基化(40.7%)；甲基化患者的血漿ADAMTS9蛋白水平顯著降低(P＜0.001)，而ADAMTS9蛋白低表達(dá)患者的血樣ADAMTS9基因甲基化水平顯著升高(P=0.007)；ADAMTS9甲基化與腫瘤大小(P=0.017)和腫瘤分化程度(P=0.029)密切相關(guān)，而ADAMTS9蛋白低表達(dá)與浸潤(rùn)深度(P=0.020)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)和Dukes分期(P=0.002)密切相關(guān)。結(jié)論：在大腸癌中，由DNA啟動(dòng)子甲基化引起的ADAMTS9蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與大腸癌的發(fā)病、侵襲轉(zhuǎn)移、并促進(jìn)病程進(jìn)展。

大腸癌；ADAMTS9；甲基化；血漿

大腸癌嚴(yán)重危害人類健康，在我國(guó)大腸癌的發(fā)病率逐年遞增，在惡性腫瘤中已位居前列，如何提高其診治療效是臨床研究的熱點(diǎn)［1-2］。含TSP結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)是一類具有金屬蛋白酶的特性的蛋白家族，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，該家族成員ADAMTS9表現(xiàn)出抑癌基因的特性，在一些惡性腫瘤中其表達(dá)降低或缺失，并且與基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)［3-7］。本研究檢測(cè)大腸癌患者和健康對(duì)照人群外周血中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化及蛋白水平，以考察其在大腸癌發(fā)病及病程進(jìn)展中的意義。

1 材料和方法

1.1 病例血樣標(biāo)本

本研究所用病例血漿樣本均來(lái)自于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，為2012年1月—2014年12月確診的大腸癌住院患者入院前留存化驗(yàn)血樣共162例，以及體檢中心留存的體檢報(bào)告結(jié)論健康的體檢者化驗(yàn)血樣150例。每例血樣標(biāo)本留存6～8 mL，并加入肝素鈉30 U/mL抗凝。新鮮收集的血樣保存于-80 ℃深度冷凍冰箱。162例大腸癌患者中，男性123例，女性39例。年齡25～77歲?；颊卟±Y料收集過(guò)程中部分缺失，其中有可用資料記錄的病例情況如下。腫瘤大小(132例)：≤5 cm 86例，＞5 cm 46例；浸潤(rùn)深度(104例)：漿膜內(nèi)77例，漿膜外27例；分化程度(156例)：高分化94例，中、低分化62例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；Dukes分期(157例)：A、B期86例，C、D期71例。大腸癌患者住院手術(shù)前未接受放療或化療。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

取-80 ℃保存的血樣，解凍后離心收集血漿。應(yīng)用ADAMTS9 ELISA試劑盒(E-ELH5481c，Elabscience Biotechnology Co. Ltd，武漢)檢測(cè)血漿中ADAMTS9蛋白水平，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

1.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)

取-80 ℃保存的大腸癌患者血樣，解凍后應(yīng)用酚-氯仿法提取血樣中總DNA，并進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾［8］。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，57 ℃(甲基化)或59 ℃(非甲基化)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，并快速冷卻至4 ℃。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶(M0226L，NEB，美國(guó))修飾的健康人外周血DNA樣本作為甲基化位點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照，健康人外周血來(lái)源DNA樣本作為非甲基化位點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照，以水替代DNA模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用凝膠成像圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集分析。電泳結(jié)果中，只要出現(xiàn)甲基化條帶，即判定DNA樣本存在甲基化；只有不出現(xiàn)甲基化條帶時(shí)，方可判定DNA樣本為非甲基化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行下述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用ELISA方法檢測(cè)ADAMTS9蛋白水平，結(jié)果以±s 表示；采用ROC曲線分析法判定變量診斷疾病的界值；采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行計(jì)量資料的組間比較；采用Pearson卡方檢驗(yàn)(χ2test)或Fisher確切概率法進(jìn)行計(jì)數(shù)資料之間的相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MSP檢測(cè)用引物序列Tab. 1 Primers sequence used in MSP analysis

2 結(jié) 果

2.1 大腸癌患者血漿ADAMTS9蛋白水平

采用ELISA方法檢測(cè)162例大腸癌患者和150例健康人血漿中ADAMTS9蛋白水平結(jié)果。與健康人［(65.25±9.70)μg，n=150］相比，大腸癌患者［(50.28±9.66) μg，n=162］血漿中ADAMTS9蛋白水平明顯降低(P＜0.001，圖1A)。采用ROC曲線分析法，依據(jù)檢測(cè)值的診斷靈敏度與特異度之和最大時(shí)，設(shè)定為血漿ADAMTS9蛋白水平診斷大腸癌的界值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAMTS9蛋白水平≤54.50 μg時(shí)有患大腸癌的趨勢(shì)(圖1B)。故定義ADAMTS9蛋白水平≤54.50 μg為低表達(dá)，＞54.50 μg為高表達(dá)。在大腸癌患者中ADAMTS9低表達(dá)者116例(71.6%)，高表達(dá)者46例(28.4%)，健康體檢者中ADAMTS9低表達(dá)者16例(10.7%)，高表達(dá)者134例(89.3%)。與健康體檢者相比，大腸癌患者ADAMTS9低表達(dá)率顯著增加(P＜0.001)。

圖1 大腸癌患者和健康人血漿中ADAMTS9蛋白水平比較Fig. 1 Comparation of ADAMTS9 protein level between colorectal cancer patients and healthy subjects

2.2 大腸癌患者外周血ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平

采用MSP法檢測(cè)162例大腸癌患者血樣中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，66例樣本ADAMTS9基因啟動(dòng)子存在甲基化，大腸癌患者人群中ADAMTS9基因甲基化率為40.7%(圖2)。

2.3 大腸癌患者血漿ADAMTS9蛋白水平與甲基化水平的相關(guān)性

比較ADAMTS9基因甲基化與非甲基化的大腸癌患者血漿ADAMTS9蛋白水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ADAMTS9非甲基化者［(54.32±9.22) μg，n=96］相比，ADAMTS9基因甲基化患者［(44.41±6.90) μg，n=66］的血漿ADAMTS9蛋白水平顯著降低(P＜0.001)。同時(shí)比較ADAMTS9蛋白低表達(dá)和蛋白高表達(dá)的患者血樣ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平發(fā)現(xiàn)，與ADAMTS9蛋白高表達(dá)者(30/94，31.9%)相比，ADAMTS9蛋白低表達(dá)患者(36/68，52.9%)的血樣ADAMTS9基因甲基化水平顯著升高(P=0.007，圖3)。

2.4 血漿ADAMTS9蛋白水平和基因甲基化水平與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析血漿ADAMTS9基因甲基化水平和蛋白水平與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與較小腫瘤相比，腫瘤較大者ADAMTS9基因甲基化率顯著增高(P=0.017)；與高分化腫瘤相比，中、低分化的腫瘤ADAMTS9基因甲基化率顯著增高(P=0.029)；與未侵及漿膜者相比，侵及漿膜外的腫瘤ADAMTS9蛋白低表達(dá)率顯著增高(P=0.020)；與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤ADAMTS9蛋白低表達(dá)率顯著增高(P=0.019)；與Dukes分期A、B者相比，Dukes分期C、D的腫瘤ADAMTS9蛋白低表達(dá)率顯著增高(P=0.002，表2)。

圖2 大腸癌患者外周血中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)Fig. 2 ADAMTS9 gene methylation analysis in peripheral blood of colorectal cancer patients

表2 血漿ADAMTS9蛋白水平和甲基化水平與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab. 2 The association of plasmatic ADAMTS9 protein level and methylation level with clinical pathological parameters in colorectal cancer patients[n(%)]

圖3 不同ADAMTS9基因甲基化水平的大腸癌患者血漿ADAMTS9蛋白水平比較Fig. 3 Comparation of plasmatic ADAMTS9 protein level between different ADAMTS9 gene methylation levels in colorectal cancer patients

3 討 論

外周血DNA樣本的抑癌基因異常甲基化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中常見(jiàn)的基因改變［9-10］，因此，檢測(cè)外周血抑癌基因DNA甲基化水平可有助于惡性腫瘤的早期篩查及診斷。本研究首次檢測(cè)了大腸癌患者外周血ADAMTS9蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，大腸癌患者血漿ADAMTS9蛋白水平降低。在許多其他惡性腫瘤中也有類似的發(fā)現(xiàn)，如Lo等［11］在鼻咽癌患者中也發(fā)現(xiàn)ADAMTS9基因表達(dá)缺失。這說(shuō)明ADAMTS9的表達(dá)下調(diào)可能也參與到大腸癌的發(fā)病。

本研究還首次檢測(cè)了大腸癌患者外周血DNA樣本中ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平，與許多已有的報(bào)道一樣［5-6,12］，本研究也檢測(cè)到ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化處于一個(gè)較高水平。而Zhang等［7］的研究也發(fā)現(xiàn)在大腸癌病理組織中存在高于癌旁組織的ADAMTS9基因甲基化水平。本研究分析了大腸癌患者外周血ADAMTS9蛋白水平與ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化與ADAMTS9蛋白低表達(dá)密切相關(guān)。DNA甲基化是基因沉默最常見(jiàn)的表遺傳學(xué)修飾之一。這說(shuō)明可能存在一個(gè)由DNA啟動(dòng)子甲基化引起的ADAMTS9蛋白表達(dá)下調(diào)從而參與大腸癌發(fā)病的機(jī)制。

本文進(jìn)一步分析ADAMTS9蛋白水平和ADAMTS9基因啟動(dòng)子甲基化水平與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS9基因甲基化與腫瘤大小(較大者)和腫瘤分化程度(較低者)密切相關(guān)，而ADAMTS9蛋白低表達(dá)與浸潤(rùn)深度(較深者)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移者)和Dukes分期(較高者C、D)密切相關(guān)。Lo等［11］在對(duì)鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)ADAMTS9表達(dá)缺失伴隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ocak等［13］上調(diào)ADAMTS9的表達(dá)有助于防止乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。這說(shuō)明ADAMTS9基因甲基化及ADAMTS9蛋白低表達(dá)都可能參與了大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移、促進(jìn)病程進(jìn)展。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)ADAMTS9基因甲基化水平和蛋白水平與臨床病理參數(shù)相關(guān)性不一致，這可能是由于DNA甲基化并非調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的唯一方式，細(xì)胞中影響蛋白表達(dá)水平的機(jī)制很多，如DNA突變、組蛋白去乙?；取Ｒ虼?，ADAMTS9基因甲基化并不能完全意義上代表ADAMTS9蛋白低表達(dá)狀態(tài)。

現(xiàn)有的研究表明ADAMTS9是1個(gè)獨(dú)立的血管生成抑制因子，從而發(fā)揮其抑癌作用［14］。王樂(lè)等［12］的研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS9基因甲基化可能參與肝癌的形成，認(rèn)為ADAMTS9基因甲基化可用以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。Ocak等［13］認(rèn)為，以ADAMTS9為靶點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤之目的。Peng等［6］認(rèn)為，基于因甲基化引起ADAMTS9基因沉默的特征，可應(yīng)用去甲基化的方法進(jìn)行多發(fā)性骨髓瘤的治療。本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌中存在由DNA啟動(dòng)子甲基化引起的ADAMTS9蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，這可能參與大腸癌的發(fā)病、侵襲轉(zhuǎn)移、并促進(jìn)病程進(jìn)展。因此，結(jié)合前述已有的研究報(bào)道，本研究認(rèn)為ADAMTS9基因甲基化有望成為大腸癌治療的新靶點(diǎn)。

［1］ JEMAL A, SIEGEL R, XU J, et al. Cancer statistics, 2010［J］. CA Cancer J Clin, 2010, 60(5):277-300.

［2］ 衛(wèi)文. 不良生活習(xí)慣導(dǎo)致大腸癌高發(fā)［J］. 家庭醫(yī)學(xué), 2012, 2(8): 32-33.

［3］ APTE S S. A disintegrin-like and metalloprotease (reprolysintype) with thrombospondin type 1 motif (ADAMTS) superfamily: functions and mechanisms［J］. J Biol Chem, 2009, 284(46): 31493-31497.

［4］ VILORIA C G, OBAYA A J, MONCADA-PAZOS A, et al. Genetic inactivation of ADAMTS15 metalloprotease in human colorectal cancer［J］. Cancer Res, 2009, 69(11): 4926-4934.

［5］ DU W, WANG S, ZHOU Q, et al. ADAMTS9 is a functional tumor suppressor through inhibiting AKT/mTOR pathway and associated with poor survival in gastric cancer［J］. Oncogene, 2013, 32(28): 3319-3328.

［6］ PENG L, YANG Z, TAN C, et al. Epigenetic inactivation of ADAMTS9 via promoter methylation in multiple myeloma［J］. Mol Med Rep, 2013, 7(3): 1055-1061.

［7］ ZHANG C, SHAO Y, ZHANG W, et al. High-resolution melting analysis of ADAMTS9 methylation levels in gastric, colorectal, and pancreatic cancers［J］. Cancer GenetCytogenet, 2010, 196(1): 38-44.

［8］ ZHAO L, WANG L, JIN F, et al. Silencing of estrogen receptor alpha (ERalpha) gene by promoter hypermethylation is a frequent event in Chinese women with sporadic breast cancer［J］. Breast Cancer Res Treat, 2009, 117(2): 253-259.

［9］ QU Y, DANG S, HOU P. Gene methylation in gastric cancer［J］. Clin Chim Acta, 2013, 424: 53-65.

［10］ FACKLER M J, LOPEZ BUJANDA Z, UMBRICHT C, et al. Novel methylated biomarkers and a robust assay to detect circulating tumor DNA in metastatic breast cancer［J］. Cancer Res, 2014, 74(8): 2160-2170.

［11］ LO P H, LUNG H L, CHEUNG A K, et al. Extracellular protease ADAMTS9 suppresses esophageal and nasopharyngeal carcinoma tumor formation by inhibiting angiogenesis［J］. Cancer Res, 2010, 70(13): 5567-5576.

［12］ 王樂(lè), 李勝棉. ADAMTS9基因甲基化檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌發(fā)生及判斷預(yù)后的價(jià)值［J］. 腫瘤, 2014, 34(3): 238-244.

［13］ OCAK Z, ACAR M, GUNDUZ E, et al. Effect of hypericin on the ADAMTS-9 and ADAMTS-8 gene expression in MCF7 breast cancer cells［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013, 17(9): 1185-1190.

［14］ KOO B H, COE D M, DIXON L J, et al. ADAMTS9 is a cell-autonomously acting, anti-angiogenic metalloprotease expressed by microvascular endothelial cells［J］. Am J Pathol, 2010, 176(3): 1494-1504.

ADAMTS9 protein downregulation induced by DNA promoter methylation could promote the progression of colorectal cancer

WANG Feng1, WANG Rui2, WANG Yanjing1(1. Department of Clinical laboratory, the First Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China; 2. Department of Clinical Laboratory, the Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning 110024, China)

WANG Yanjing E-mail: 15541192550@163.com

Background and purpose:The morbidity of colorectal cancer in China increased year by year. This study aimed to explore the significance of ADAMTS9 protein levels and promoter methylation in colorectal cancer onset and progression.Methods:ADAMTS9 promoter methylation status was detected by methylation specific PCR method in 162 colorectal cancer patients’ peripheral blood DNA samples; Plasmatic ADAMTS9 protein levels was detected by enzyme-linked immunosorbent assay method in 162 colorectal cancer patients and 150 healthy subjects.Results:Compared with healthy people, patients with colorectal cancer had a significant lower ADAMTS9 protein level in plasma [(65.25±9.70)μg vs (50.28±9.66)μg, P＜0.001]; ADAMTS9 gene promoter methylation was observed in 66 among 162 colorectal cancer patients (40.7%); The plasma level of ADAMTS9 protein in patients with methylated ADAMTS9 gene had significantly reduced (P＜0.001), while the plasma level of ADAMTS9 protein in patients with low ADAMTS9 protein had significantly increased (P=0.007); ADAMTS9 methylation is closely related to tumor size (larger, P=0.017) and tumor differentiation degree (P=0.029), ADAMTS9 protein low expression is closely related to invasion depth (P=0.020), lymph node metastasis (P=0.019) and Dukes staging (P=0.002).Conclusion:ADAMTS9 protein downregulation induced by DNA promoter methylation may be involved in the pathogenesis, invasion and metastasis, and promote the progression in colorectal cancer.

Colorectal cancer; ADAMTS9; Methylation; Plasma

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.06.007

R735.3+4

：A

：1007-3639(2015)06-0446-06

2014-12-08

2015-05-10）

王衍晶 E-mail:15541192550@163.com