燈盞花素對(duì)腦梗死大鼠腦保護(hù)作用的影像學(xué)觀察及機(jī)制研究*

夏旺旭徐 露

（1.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400012；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

·研究報(bào)告·

燈盞花素對(duì)腦梗死大鼠腦保護(hù)作用的影像學(xué)觀察及機(jī)制研究*

夏旺旭1徐 露2△

（1.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400012；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

目的采用核磁共振（MRI）技術(shù)，觀察燈盞花素對(duì)腦梗死大鼠的保護(hù)作用并探索其機(jī)制。方法120只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、尼莫地平組和燈盞花素組。除空白組外，其余各組動(dòng)物腦制造腦梗死模型，尼莫地平組和燈盞花素組于梗死后每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg和燈盞花素4 mg/kg，模型組注射同等體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)4 d。缺血后24 h、48 h和96 h，用MRI對(duì)大鼠兩側(cè)紋狀體區(qū)和頂顳葉區(qū)進(jìn)行T1-SE及DW-EPI序列掃描，分析表觀彌散系數(shù)（ADC）值的變化；并用干濕重法計(jì)算腦含水量及western法檢測(cè)APQ4水平的變化。結(jié)果與模型組相比，燈盞花素組組大鼠腦缺血后24 h、48 h及96 h，左側(cè)紋狀體和頂顳葉相對(duì)ADC值著增加（P＜0.01），腦含水量及APQ4值顯著降低（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組相當(dāng)（P＞0.05）。結(jié)論燈盞花素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠有一定的減輕腦水腫的作用，其機(jī)制可能與抑制APQ4的表達(dá)有關(guān)。

腦梗死 燈盞花素 ADC APQ4

燈盞花素是從菊科植物燈盞花中提取的黃酮類(lèi)有效成分，主要成分是燈盞乙素，具有廣泛的藥理活性，如改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管、增加血流量、調(diào)節(jié)血脂、抗血栓、降低血黏度等。文獻(xiàn)研究表明燈盞花素對(duì)腦缺血再灌注損傷和心肌缺血均有保護(hù)作用。目前，利用MRI法觀測(cè)燈盞花素對(duì)急性腦梗死大鼠腦水腫和腦梗死體積的作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步揭示燈盞花素對(duì)腦梗死的影響，本研究以大鼠腦梗死為實(shí)驗(yàn)研究模型，觀察燈盞花素對(duì)腦梗死大鼠MRI、腦水腫及APQ4蛋白的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)成年雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（250±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 燈盞花素注射液，購(gòu)至湖南恒生制藥有限公司，燈盞花素注射液1 mg溶解于0.9%氯化鈉注射液1 mL中。尼莫地平，購(gòu)至通化神源藥業(yè)有限公司。APQ4抗體購(gòu)至Santa Cruz。Siemens 1.5 T磁共振儀，SynGENE凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 分組與造模 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠120只隨機(jī)分為4組：空白組（n=30）、模型組（n=30）、尼莫地平組（n=30）和治療組（n=30）。除空白組外，采用Longa等的線栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈永久缺血腦梗死模型［2］。

1.4 給藥 參照文獻(xiàn)報(bào)道［1］，治療組按照4 mg/kg劑量每日腹腔注射燈盞花素，對(duì)照組注射0.9%氯化鈉注射液1 mL。尼莫地平組每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg。

1.5 觀察指標(biāo) 1）核磁共振掃描和圖像分析：MRI檢測(cè)在重慶醫(yī)科大學(xué)生物工程中心核磁共振室完成。梯度場(chǎng)設(shè)為40 mT/m，軸向的轉(zhuǎn)換速率設(shè)為400 T/（m· s）。4組大鼠分別在腦梗死后24 h、48 h和96 h進(jìn)行掃描。掃描使用Rat Coil，且大鼠保持在相同位置。腦梗死后24 h、48 h和96 h分別完成如下序列：T1自旋回波序列（T1SE），TR 600 ms，TE 13 ms，F(xiàn)OV read 50 mm，層厚1 mm，層數(shù)15層，Averages 4，F(xiàn)lip angle 90°，Base resolution256×256。DW-EPI序列，TR3300ms，TE99ms，層厚2 mm，層數(shù)8層，F(xiàn)OV read 67 mm，Averages 4，Base resolution 100×100。完成序列掃描的順序?yàn)椋篋WEPI和T1-TSE。掃描后，使用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。選取同一定位層面的掃描序列圖像 （額皮質(zhì)前尖部后7 mm的冠狀切面）進(jìn)行分析。在此層面選取缺血側(cè)紋狀體區(qū)、頂顳葉區(qū)，對(duì)側(cè)紋狀體區(qū)和頂顳葉區(qū)4個(gè)區(qū)域。然后計(jì)算4區(qū)域在缺血后24 h、48 h和96 h的ADC值。本研究采用相對(duì)ADC值進(jìn)行比較以減少動(dòng)物個(gè)體差異影響。相對(duì)ADC值=患側(cè)ADC值/健側(cè)ADC值。2）腦含水量的檢測(cè)：每組于腦梗死后24 h、48 h和96 h時(shí)間點(diǎn)，分別處死5只大鼠，迅速取出腦組織，去除小腦、腦干和嗅球，用濾紙吸取多余水分后稱(chēng)其濕重。隨后放入恒溫電熱箱中于105℃烘烤至恒重，稱(chēng)其干重。按照如下公式計(jì)算腦組織含水量：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）腦APQ4表達(dá)的測(cè)定：每組于腦梗死后24 h、48 h和96 h時(shí)間點(diǎn)，分別處死5只大鼠，迅速取出腦組織，提取總蛋白。Western blot法檢測(cè)APQ4蛋白的表達(dá)。Image lab軟件計(jì)算目的蛋白和β-actin條帶灰度值。APQ4值的表達(dá)量由目的蛋白和β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組紋狀體區(qū)缺血后 24 h、48 h和 96 h相對(duì)ADC值比較 見(jiàn)表1。缺血后24 h、48 h和96 h，于紋狀體區(qū)，模型組相對(duì)ADC值均小于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組紋狀體區(qū)缺血后各時(shí)點(diǎn)相對(duì)ADC值比較（±s）

表1 各組紋狀體區(qū)缺血后各時(shí)點(diǎn)相對(duì)ADC值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。下同。

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 8*模型組 5 0 . 6 9 ± 0 . 0 3尼莫地平組 5 0 . 8 8 ± 0 . 0 8*0 . 9 9 ± 0 . 0 9*1 . 0 2 ± 0 . 0 6*0 . 6 2 ± 0 . 0 8 0 . 5 3 ± 0 . 0 4 0 . 9 0 ± 0 . 0 6*0 . 7 9 ± 0 . 0 7*燈盞花素組 5 0 . 9 0 ± 0 . 0 5*0 . 9 2 ± 0 . 0 3*0 . 8 1 ± 0 . 0 6*

2.2 各組頂顳葉區(qū)缺血后 24 h、48 h和96 h相對(duì)ADC值的變化 見(jiàn)表2。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組相對(duì)ADC值均小于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組頂顳葉區(qū)缺血后各時(shí)點(diǎn)相對(duì)ADC值比較（分，±s）

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 6*模型組 5 0 . 7 7 ± 0 . 0 4尼莫地平組 5 0 . 9 3 ± 0 . 0 5*0 . 9 8 ± 0 . 0 7*1 . 0 1 ± 0 . 0 8*0 . 7 5 ± 0 . 0 3 0 . 6 1 ± 0 . 0 2 0 . 9 8 ± 0 . 0 6*0 . 8 2 ± 0 . 0 5*燈盞花素組 5 0 . 9 5 ± 0 . 0 3*0 . 9 7 ± 0 . 0 5*0 . 8 3 ± 0 . 0 4*

2.3 各組腦含水量比較 見(jiàn)表3。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組腦含水量值均高于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組缺血后各時(shí)點(diǎn)腦含水量比較（±s）

表3 各組缺血后各時(shí)點(diǎn)腦含水量比較（±s）

組別n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白組 5 0 . 7 0 ± 0 . 0 3*模型組 5 0 . 8 1 ± 0 . 0 4尼莫地平組 5 0 . 7 3 ± 0 . 0 5*0 . 7 1 ± 0 . 0 4*0 . 6 9 ± 0 . 0 5*0 . 8 6 ± 0 . 0 7 0 . 8 4 ± 0 . 0 6 0 . 7 7 ± 0 . 0 5*0 . 7 4 ± 0 . 0 3*燈盞花素組 5 0 . 7 2 ± 0 . 0 4*0 . 7 5 ± 0 . 0 5*0 . 7 2 ± 0 . 0 3*

2.4 各組腦APQ4表達(dá)的測(cè)定 見(jiàn)表4。缺血后24 h、48 h和96 h，模型組腦APQ4蛋白的表達(dá)均高于空白組、尼莫地平組及燈盞花素組（P＜0.01），而尼莫地平組和燈盞花素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

腦梗死后腦組織缺血、缺氧會(huì)引起腦水腫。腦水腫程度與腦梗死的損傷尤其是梗死灶大小密切相關(guān)，腦損傷嚴(yán)重者相應(yīng)腦水腫也會(huì)嚴(yán)重［3］。腦水腫進(jìn)一步發(fā)展就會(huì)發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死。腦水腫在腦組織損傷后立即發(fā)生，在24～72 h最為明顯，持續(xù)時(shí)間約為1周［4］。腦水腫程度可以判斷腦梗死后腦損傷的嚴(yán)重程度，在腦梗死發(fā)生初期如果能及時(shí)控制腦水腫，對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸和愈后具有重要的意義［5］。

表4 各組缺血后各時(shí)點(diǎn)腦APQ4蛋白的表達(dá)（±s）

表4 各組缺血后各時(shí)點(diǎn)腦APQ4蛋白的表達(dá)（±s）

組別n 24 h 48 h96 h空白組 5 0.046±0.022*0.044±0.023*0.047±0.020*模型組 5 0.133±0.056 0.130±0.0520.128±0.054尼莫地平組 5 0.064±0.033*0.060±0.036*0.055±0.032*燈盞花素組 5 0.060±0.028*0.056±0.027*0.050±0.025*

隨著MRI技術(shù)的興起與發(fā)展，腦水腫的程度和發(fā)展情況能夠被監(jiān)測(cè)。在細(xì)胞毒性水腫和神經(jīng)元細(xì)胞皺縮發(fā)生過(guò)程中，ADC值是重要的敏感參數(shù)；腦缺血急性期，由于腦細(xì)胞缺血缺氧，膜去極化，細(xì)胞外水分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，使得ADC值發(fā)生變化［6］。在腦缺血急性期，缺血區(qū)域的ADC值明顯下降，ADC值越低表明腦損傷越嚴(yán)重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ADC下降程度與急性腦缺血后的組織損傷程度有一定相關(guān)性［7］。DWI能反映水分子擴(kuò)散特性，對(duì)水分子運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散十分敏感。DWI的信號(hào)直接與ADC值有關(guān)，兩者信號(hào)強(qiáng)度相反。ADC值可通過(guò)對(duì)DWI影像物理參數(shù)的測(cè)量計(jì)算得出［8］。腦梗死大鼠紋狀體和頂顳葉區(qū)的ADC變化由表1和表2可以看出，腦梗死大鼠ADC的變化為先降低后逐漸升高，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道［7］相一致，說(shuō)明此時(shí)腦梗死大鼠正從梗死急性期往亞急性期過(guò)度。比較模型組和治療組大鼠，在腦梗死后24 h、48 h及96 h時(shí)間點(diǎn)，燈盞花素組大鼠能顯著升高腦梗死大鼠紋狀體和頂顳葉區(qū)的ADC值，說(shuō)明燈盞花素具有降低腦梗死大鼠急性期腦水腫的作用。

APQ4蛋白是分布于膠質(zhì)細(xì)胞膜區(qū)和室管膜細(xì)胞的一種雙向水轉(zhuǎn)運(yùn)通道，它是膠質(zhì)細(xì)胞-腦脊液-血管水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要物質(zhì)［9］。APQ4與腦水腫關(guān)系密切，在腦梗死的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中其都有不同程度的表達(dá)。研究表明，APQ4基因敲除鼠在腦缺血后星型膠質(zhì)細(xì)胞腫脹及腦組織含水量均顯著低于野生型小鼠，表明APQ4與腦缺血后的腦水腫關(guān)系密切［10］。本研究結(jié)果示，在腦梗死后24 h、48 h及96 h時(shí)間點(diǎn)，燈盞花素能顯著降低腦梗死大鼠腦含水量及APQ4蛋白的表達(dá)，說(shuō)明燈盞花素可能是通過(guò)抑制APQ4的表達(dá)來(lái)減輕腦水腫。尼莫地平是公認(rèn)的治療腦梗死的有效藥物，能顯著改善腦水腫情況，從各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)看來(lái)，燈盞花素組和尼莫地平組無(wú)顯著性差異，表明燈盞花素與尼莫地平作用相似。

另外，腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，其病因以?xún)?nèi)傷積損為主，即臟腑失調(diào)，陰陽(yáng)偏勝?；钛?、息風(fēng)通絡(luò)是“中風(fēng)”主要治法之一。燈盞花素是中藥燈盞花的主要有效成分，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用。因此，可采用燈盞花素治療“卒中”，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。

綜上所述，通過(guò)MRI的方法，我們可以直觀地發(fā)現(xiàn)燈盞花素對(duì)大鼠永久性中動(dòng)脈梗塞模型所導(dǎo)致的缺血性腦損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與燈盞花素抑制APQ4蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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Imaging Observations and Mechanism Research of the Protective Effect of Breviscapine on Rats with Cerebral Infarction

XIA Wangxu，XU Lu. People's Hospital of Changshou District of Chongqing，Chongqing 400012，China

Objective：To observe the protective effects and mechanism of breviscapine on rats with cerebral infarction by the means of MRI.Methods：120 SD rats were randomly divided into the control group（n=30），model group（n=30），nimodipine group（n=30）and breviscapine group（n=30）.The rats were made into cerebral infarction model，except the control group.The breviscapine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 4 mg/kg per day for 4 days after the surgery.Nimodipine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 1 mg/kg per day.The rats in the control group received the same dose of saline injection.At 24 h，48 h and 96 h after MCAO，the striatum and parietotemporal cortex were scanned with MRI，as well as the sequence of T1-SE and DW-EPI and the changes of ADC values were analyzed. The value of brain water content and APQ4 expression were calculated.Results：Compared with model group，the relative ADC value of the striatum and parietotemporal cortex in breviscapone group significantly increased（P＜0.01），and brain water content and APQ4 decreased，at 24 h，48h and 96h after MCAO（P＜0.01），and there was no difference between nimodipine group and breviscapine group（P＞0.05）.Conclusion：Breviscapone can reduce the cerebral edema after cerebral ischemia and mitigate further damage of brain.

Breviscapine；Cerebral infarction，ADC，APQ4

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0950-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.005

2015-01-16）

重慶市第六屆“步長(zhǎng)杯”腦血管病科學(xué)研究基金面上項(xiàng)目（BCB2012010）

△通信作者（電子郵箱：30067011@qq.com）