加味芎蝎散對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道重塑及氣道平滑肌相關(guān)凋亡分子表達的影響*

孫洮玉 王俊宏 徐榮謙

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

·研究報告·

加味芎蝎散對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道重塑及氣道平滑肌相關(guān)凋亡分子表達的影響*

孫洮玉 王俊宏 徐榮謙△

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

目的探討加味芎蝎散對咳嗽變異性哮喘（CVA）大鼠氣道重塑的作用及相關(guān)凋亡分子表達。方法40只大鼠隨機分成對照組、模型組、順爾寧組、加味芎蝎散組；造模后分組給予相應(yīng)的藥物干預(yù)；采用HE觀察各組支氣管上皮細胞損傷情況、Masson染色法對大鼠支氣管厚度，平滑肌厚度及膠原纖維沉積進行檢測，免疫組化法檢測氣道平滑肌凋亡相關(guān)分子Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase3的表達。結(jié)果模型組支氣管上皮變性、壞死，支氣管厚度增加，膠原纖維沉積明顯，氣道平滑肌細胞Bax/Bcl-2、Fas、Caspase3表達減少，而順爾寧組、加味芎蝎散組具有明顯升高的作用。結(jié)論加味芎蝎散可通過促進氣道平滑肌凋亡分子的表達來減輕CVA大鼠的氣道重塑作用，從而發(fā)揮對于CVA的治療作用。

氣道重塑 氣道平滑肌 凋亡 加味芎蝎散 咳嗽變異性哮喘

咳嗽變異性哮喘（CVA）是哮喘的一種特殊類型，以咳嗽為主要或者唯一表現(xiàn)。西醫(yī)學(xué)采用激素為主的治療方案，并不能根治，且長期應(yīng)用有一定副作用，而中醫(yī)藥臨床療效確切。本研究在成功制備了CVA模型后，重點對氣道各層（主要是氣道平滑肌組織）的主要凋亡分子（Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase3）表達情況做了研究，同時采用Masson特殊染色，病理圖像分析各組氣道平滑肌層厚度及膠原纖維含量，以進一步明確以活血祛風(fēng)法為治則的加味芎蝎散治療CVA大鼠的作用機制及可能的作用靶點?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量15～22 g，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物中心。

1.2 藥物 孟魯司特鈉（順爾寧），杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。加味芎蝎散基本方為川芎5 g，全蝎3 g，細辛1 g，蓽茇1 g，半夏5 g，白前10 g，五味子10 g，蘆根20 g，東直門醫(yī)院制劑室提供。

1.3 試劑與儀器 卵蛋白VOA（美國Sigma公司），氫氧化鋁 （北京化學(xué)試劑廠），F(xiàn)as、FasL、Bcl－2、Bax及Caspase3兔多克隆抗體 （美國Abcam公司）；二抗Pv6001（北京中杉金橋公司）。超聲波霧化器（上海魚躍醫(yī)療器械有限公司），RM2125石蠟切片機（德國Leica公司），Olympus bx51顯微鏡 （日本Olympus公司），IPP6.0（美國Media公司）

1.4 分組及造模 大鼠隨機分組為正常對照組、模型組、順爾寧組、加味芎蝎散組，每組各12只。模型建立參照文獻［1］報道，并加以改進：造模動物第1日肌注4%OVA溶液0.5 mL，同時腹腔注射2%Al（OH）30.2 mL，從第14日開始，用1%OVA溶液霧化攻擊，隔日1次，共7次。并通過造模后總體外觀、病理鏡下檢測及白細胞、嗜酸粒細胞計數(shù)等檢測完成。加味芎蝎散組以蒸餾水煎汁后用生理鹽水配成相當(dāng)于生藥3.0 g/mL藥液，分別按設(shè)計劑量灌胃給藥 ［劑量為50 g/（kg·d）］。順爾片組每次給予1.3 mg/kg。正常組每次給予等容積生理鹽水，連續(xù)27 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 給藥28 d后各組取右下肺固定部位塊，一半-80℃凍存，另一半4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE鏡下觀察，Masson特染，病理圖像分析平滑肌和膠原增生；免疫組化檢測蛋白的表達情況。

1.5.1 HE染色方法及形態(tài)學(xué)觀察標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本固定，石蠟包埋，切片5 μm厚度，蘇木素-伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。形態(tài)學(xué)觀察標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 CVA大鼠氣道上皮損傷程度量化標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 Masson染色法 使用北京中杉Masson染色特染試劑盒，鏡下觀察結(jié)果：平滑肌染為紅色，膠原纖維染成綠色。分別測量支氣管基底膜周徑（Pbm，μm），總管壁面積（WAt，μm2），管壁平滑肌面積（WAm，μm2），所有測量值均用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，即WAt/Pbm，WAm/Pbm，分別可代表支氣管管壁厚度及相應(yīng)平滑肌層厚度。

1.5.3 免疫組化染色方法石蠟切片脫蠟至水，枸緣酸緩沖液高壓抗原修復(fù)，加一抗（各種抗體稀釋度均為1∶100），4℃過夜，二抗，DAB顯色，鏡下觀察；水洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明封片。結(jié)果判定，陽性細胞為棕黃色，定位于胞漿。采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測定相關(guān)蛋白含量，以平均光密度表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，各組計量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

光鏡下HE染色結(jié)果如圖1所示，模型組上皮細胞變性，脫落，損傷，基底膜不完整。順爾寧組和加味芎蝎散組均有明顯的減輕作用。模型組膠原纖維沉積增加，管壁厚度和平滑肌厚度均較其他各組有明顯的增加，而順爾寧組和加味芎蝎散組亦有明顯的減輕作用。見圖1、圖2、表2、表3。

圖1 各組肺組織中Bax表達（SP法，200倍）

圖2 各組肺組織中Caspase3表達（SP法，200倍）

3 討 論

目前認為，氣道平滑肌細胞（ASMC）凋亡減低是哮喘氣道重塑形成的一個主要機制，如De D［2］發(fā)現(xiàn)，氣道平滑肌細胞可接受如IL-8、TGF-β等細胞因子的刺激，平滑肌細胞增生，凋亡減少，遷移，從而導(dǎo)致氣道重塑。Halwani R等［3］發(fā)現(xiàn)趨化因子如eotaxin、RANTES、IL-8以及MIP-1α等可以促進氣道平滑肌細胞遷移，抑制細胞凋亡?，F(xiàn)已證實，F(xiàn)as通路（外源性凋亡通路）異常表達是抑制ASMC凋亡的重要原因［4］，bcl-2與bax基因是bcl-2基因家族中最具有代表性的抑制凋亡與促進凋亡的基因［5］。研究發(fā)現(xiàn)，在Caspase家族成員中，Caspase3是各種細胞凋亡刺激因子激活的Caspase家族中最關(guān)鍵的蛋白酶，與細胞凋亡最為相關(guān)。Caspase3不僅很好的反應(yīng)細胞凋亡的程度，而且參與細胞凋亡的較晚期階段［6］。

表2 各組CVA大鼠氣道上皮、膠原、平滑肌及管壁厚度結(jié)果（μm，±s）

表2 各組CVA大鼠氣道上皮、膠原、平滑肌及管壁厚度結(jié)果（μm，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，*P＜0.01。下同。

組別 上皮損傷 管壁厚度（W A t / P b m）膠原沉積 平滑肌厚度（W A m / P b m）正常對照組 1 . 0 0 ± 0 . 6 5**9 . 8 0 ± 1 . 2 4**模型組 4 . 0 0 ± 1 . 5 4 1 6 . 4 5 ± 1 . 5 5順爾寧組 2 . 0 0 ± 1 . 1 8*1 2 . 5 4 ± 1 . 7 2*4 . 8 4 ± 0 . 8 2**3 . 5 2 ± 0 . 5 2**1 5 . 8 4 ± 2 . 8 2 6 . 9 0 ± 0 . 7 7 1 0 . 4 5 ± 1 . 7 2 4 . 4 4 ± 0 . 6 8**加味芎蝎散組2 . 0 0 ± 1 . 5 0*1 3 . 8 8 ± 1 . 8 4*8 . 9 0 ± 1 . 9 4*4 . 8 0 ± 0 . 4 4*

表3 各組肺組織平滑肌免疫組化結(jié)果（積分光密度值，±s）

表3 各組肺組織平滑肌免疫組化結(jié)果（積分光密度值，±s）

組別 B a x / B c l -2 C a s p a s e 3 F a s F a s L正常對照組 4 3 8 4 . 8 5 ± 4 1 2 . 5 5**2 8 6 5 . 6 3 ± 3 0 8 . 2 0**模型組 1 8 7 6 . 2 5 ± 1 8 7 . 6 3 9 9 5 . 4 2 ± 1 0 8 . 8 0順爾寧組 2 9 8 6 . 3 6 ± 3 3 5 . 2 5*1 5 6 9 . 2 3 ± 1 4 4 . 5 2**4 0 5 2 . 5 8 ± 4 3 9 . 3 6**2 0 3 4 . 5 5 ± 1 9 4 . 8 5 2 0 3 9 . 3 5 ± 1 8 7 . 2 5 1 8 6 5 . 5 6 ± 1 5 5 . 2 0 3 3 5 8 . 5 2 ± 2 3 1 . 2 0*1 9 8 5 . 5 6 ± 2 2 0 . 2 5加味芎蝎散組2 5 0 8 . 2 3 ± 2 3 7 . 2 5**1 4 9 3 . 5 2 ± 2 1 8 . 2 9**3 6 0 2 . 2 3 ± 2 9 7 . 9 6*2 0 1 2 . 5 2 ± 1 5 6 . 2 0

芎蝎散是宋代陳文中《小兒病源方論》的家傳累世之名方，主要用于治療痰滿胸喉、眼珠斜視證，或用于治療痰氣壅塞不能咽藥。徐榮謙教授吸收中醫(yī)兒科先賢使用芎蝎散之寶貴經(jīng)驗，經(jīng)過多年臨床驗證，在芎蝎散的基礎(chǔ)上加白前10 g，五味子10 g，蘆根20 g，形成加味芎蝎散。方中川芎活血行氣；全蝎搜風(fēng)通絡(luò)以散肺風(fēng)；細辛、蓽茇、半夏溫肺化痰；白前溫肺降氣祛痰；五味子斂肺止咳；蘆根清肺止咳。諸藥合用，共奏祛風(fēng)化痰之功。正所謂“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅；止咳先祛痰，痰祛咳自止”。筆者在2005至2007年對咳嗽變異性患兒的治療效果進行了病歷臨床隨訪觀察，證實該方能顯著減少患兒咳嗽、有痰、咽癢、咽紅等癥狀［7］。

本次研究采用實驗動物在體研究，發(fā)現(xiàn)CVA模型組損傷主要涉及上皮變性，平滑肌細胞增生，膠原沉積等，而加味芎蝎散組與順爾寧組對此3方面均有明顯的緩解作用。促凋亡分子Caspase3、Bax、Fas在CVA模型組表達降低，抗凋亡分子Bcl-2亦輕度減低，而加味芎蝎散組與順爾寧組對促凋亡分子有明顯的增強作用。同時也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性凋亡通路分子FasL在各組均沒有明顯差異。另外，研究表明，外源性凋亡通路分子中，CAV大鼠氣道平滑肌相對于其他各組Fas低表達，而FasL表達率沒有差異，這與以往文獻報道較一致［8］；在順爾寧組和加味芎蝎散組中，F(xiàn)as表達均明顯高于模型組。在內(nèi)源性凋亡（線粒體）通路，筆者研究發(fā)現(xiàn)作用拮抗的一對分子Bax和Bcl-2在CVA的ASM中都是減低的，同時Bax/Bcl-2也是降低的，說明是促凋亡和抑制凋亡的因素的共同作用過程，這也進一步解釋以前的研究報道中出現(xiàn)不同觀點的原因。本實驗數(shù)據(jù)證實模型組Caspase3表達減低，Caspase3的激活減少最終導(dǎo)致平滑肌細胞凋亡減少，遷移增多的發(fā)生，而加味芎蝎散組Caspase3明顯增加，從而促進平滑肌細胞凋亡。

根據(jù)當(dāng)前研究，初步得出結(jié)論：氣道平滑肌凋亡減少是CVA大鼠氣道重塑的主要病理變化之一，而加味芎蝎散有增加氣道平滑肌的凋亡的作用，可能機制是通過調(diào)節(jié)凋亡分子Caspase3、Bax、Fas的表達。筆者期望下一步能對培養(yǎng)的平滑肌細胞實時觀察選定時間點的增殖、凋亡、遷移情況，以進一步分析CVA氣道重塑平滑肌發(fā)生變化及中藥加味芎蝎散的治療作用相關(guān)的分子機制。

［1］ 蔡黎，畢小利，王憶勤，等.咳嗽變異性哮喘豚鼠模型的構(gòu)建［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，38（2）：1070-1073.

［2］ De D，RP.The epidermal growth factor receptor and its ligand family：their potential role in repair and remodelling in asthma［J］.Allergy，1999，54（8）：771-783.

［3］ Halwani R1，Al-Abri J.CC and CXC chemokines induce airway smooth muscle proliferation and survival［J］.J Immunol，2011，186（7）：4156-4163.

［4］ Hamann KJ，Vieira JE．Fas cross-linking induces apoptosis in human airway smooth muscle cells［J］.American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2000，278（3）：618-624.

［5］ 周蘭英，孫圣華，李定梅，等.bcl-2及bax表達與COPD大鼠骨骼肌細胞凋亡的相關(guān)性［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（8）：104-108.

［6］ Honarpour N，Du C，Richardson JA，et al.Adult Apaf-I-deficient mice exhibit male infertility［J］.Derbiol，2000，218（2）：245-258.

［7］ 伍利芬.加味芎蝎散治療小兒咳嗽變異性哮喘臨床療效觀察［J］.北京中醫(yī)，2007，26（10）：665-667.

［8］ Druilhe A，Wallaert B.Apoptosis，proliferation，and expression of Bcl-2，F(xiàn)as，and Fas ligand in bronchial biopsies from asthmatics［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，19（5）：747-757.

Effects of Modified Xiongxie San on Airway Remolding in CVA Rats and the Expression of Related Apoptosis Factor

SUN Taoyu，WANG Junhong，XU Rongqian. Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Objective：To explore the inhibit effect of Modified Xiongxie San on airway remolding in cough variant asthma（CVA）rats and the expression of related apoptosis factor.Methods：40 rats were randomly and equally divided into 4 groups：control group，CVA groups，Montelukast Sodium group，Modified Xiongxie San group.CVA models were established by sensitization and stimulation with ovalbumin in CVA groups，Montelukast Sodium group，Modified Xiongxie San group.Corresponding measures were given according to the groups.The degeneration and injury of bronchial epithelial cell were measured by HE staining.The airway wall thickness and the bronchial smooth muscle thickness were measured by Masson staining.The expressions of Bax，Bcl-2，F(xiàn)AS，F(xiàn)ASL and Caspase3 were detected by immunohistochemical staining.Results：Bronchial epithelial demonstrate degeneration，necrosis，bronchial thickness increased，the collagen fibers deposition in the model group.The expression of Bax/Bcl-2，F(xiàn)AS，Caspase3 of airway smooth muscle cells decreased，while positive drug group relieve group had a significantly improved role.Conclusion：Modified Xiongxie San group may relieve airway remodeling in CVA rats by improving airway smooth muscle apoptosis molecule expression so as to play for cough variant asthma treatment effect.

Airway remodeling；Airway smooth muscle；Apoptosis；Modified Xiongxie San；Cough variant asthma

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0406-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.010

2014-12-16）

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題資助項目（2011JYB22J5-009）

△通信作者（電子郵箱：suntaoyu＠163.com）