花生發(fā)芽過程中脂氧合酶活力的變化

張雅君，楊 選，楊 震，韓永斌*

花生發(fā)芽過程中脂氧合酶活力的變化

張雅君，楊 選，楊 震，韓永斌*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

選用“花育30號(hào)”品種作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)花生脂氧合酶活力的測定體系進(jìn)行優(yōu)化，研究發(fā)芽過程中花生不同部位脂氧合酶活力的變化。結(jié)果表明：花生脂氧合酶活力測定的最適條件為：測定溫度32℃，磷酸鹽緩沖液pH 6.8，磷酸鹽緩沖液濃度0.10 mol/L。發(fā)芽36 h時(shí)花生脂氧合酶活力最高，其后酶活力總體呈下降趨勢。該酶在子葉和胚芽中的活力呈現(xiàn)出與全?；ㄉ鷰缀跸嗤淖兓厔荩遗哐恐忻富盍Ρ茸尤~中酶活力低。

花生；發(fā)芽；脂氧合酶

花生（Arachis hypogaeaL.）為蝶形花科，落花生屬植物，花生仁中脂肪含量為44.27%～58%，蛋白質(zhì)含量25%～36%。在世界范圍內(nèi)，花生油占食用植物油年產(chǎn)量的14%，居世界第4位，花生植物蛋白資源居第3位，占世界植物蛋白年產(chǎn)量的11%，是重要的食用植物油和植物蛋白資源[1]。我國是世界三大花生主產(chǎn)國之一，總產(chǎn)量在1 000萬t左右，約占世界總產(chǎn)量的30%以上，占我國油料作物總產(chǎn)量的50%左右，其單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口量均居世界首位[2]。作為重要的油料資源，花生中有8種脂肪酸，其中油酸和亞油酸約占80%，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[3]。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12），也稱作脂肪氧化酶，是一種廣泛存在于動(dòng)植物體、真菌和細(xì)菌中的氧化還原酶[4-6]。LOX在生物體內(nèi)的主要作用是催化含有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸及其相應(yīng)酯類的加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸氫過氧化物，統(tǒng)稱為氧脂。谷物、豆類等種子中固有的LOX能催化不飽和脂肪酸過氧化，形成脂肪酸氫過氧化物從而對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味產(chǎn)生不良影響[7-9]。LOX也具有有利的一面，有研究表明在小麥粉中加入部分的大豆粉或是純化的大豆LOX可以提高面筋筋力，改變面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)，改善面團(tuán)的穩(wěn)定性并且具有增白劑的效果[10-13]。來源于大豆的LOX在大多數(shù)歐洲國家已被允許作為面粉酶制劑使用[14]。此外，在生物體外利用LOX氧化油脂產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可以作為香精等天然的食品添加劑[15]。LOX在食品加工中的應(yīng)用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

關(guān)于谷物豆類種子發(fā)芽過程中LOX活性變化的研究主要集中在大豆上，蔣和體等[16]研究發(fā)現(xiàn)大豆LOX活力隨發(fā)芽時(shí)間延長而降低。而趙甲慧[17]研究發(fā)現(xiàn)大豆發(fā)芽后LOX活性總體提高，在芽長2 cm時(shí)活性最強(qiáng)，是未發(fā)芽種子中LOX酶活力的2倍左右。對(duì)于花生種子發(fā)芽方面的研究，目前主要集中在花生生理生化[18-19]、蛋白酶抑制劑[20]、過敏原[21]和貯藏蛋白種類及含量變化[22]方面。而對(duì)花生LOX的研究則主要集中在酶活性測定以及同工酶鑒定等方面[23]。花生發(fā)芽過程中LOX活性變化規(guī)律的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬檢測發(fā)芽處理過程中LOX活力的變化，旨在探索花生發(fā)芽過程中LOX的變化規(guī)律，為研究LOX在花生發(fā)芽過程中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

供試花生為“花育30號(hào)”，由徐州金農(nóng)種子公司提供，4℃避光保存。將發(fā)芽處理的花生每隔12 h取樣，因花生芽苗在發(fā)芽96 h后長出側(cè)根及嫩葉，并且芽苗已出現(xiàn)木質(zhì)化，故后面實(shí)驗(yàn)均采用發(fā)芽96 h以內(nèi)的花生作為研究材料。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）汕頭市西隴化工廠；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）（生化試劑）上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（生化試劑）中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；亞油酸鈉（分析純）阿拉丁試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；JA2003型電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；PGX-250智能光照培養(yǎng)箱寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；BX-801貝欣智能芽菜機(jī)沈陽夢飛揚(yáng)科技有限公司；Orion818型pH測試儀默飛世爾科技（中國）公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)湖南湘儀公司；TDL-40B離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1花生LOX粗酶液的提取

粗酶液的提取參考文獻(xiàn)[24]的方法做部分調(diào)整：將5 g去紅衣花生加入40 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）于冰浴下研磨成勻漿后4℃、12 000 r/min離心40 min，取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 LOX活力測定方法

根據(jù)文獻(xiàn)[24]方法，經(jīng)過調(diào)整后采用3 mL反應(yīng)體系，以亞油酸鈉為底物。取磷酸鹽緩沖溶液2.90 mL、花生LOX粗酶液60μL、5 mmol/L的亞油酸鈉40μL混合均勻，在234 nm波長處觀察OD234nm的變化，每10 s記數(shù)1次，5 min后停止記錄，平行測定5次，結(jié)果取平均值，繪制OD234nm變化曲線，選取OD234nm隨時(shí)間變化呈線性且斜率最大的部分計(jì)算酶活力。以每分鐘OD234nm增加0.01所需的酶量作為LOX的一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 LOX活力測定方法的優(yōu)化

1.3.3.1溫度對(duì)LOX活力的影響

選擇0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，溫度設(shè)置在18～40℃，每2℃一個(gè)梯度，共11個(gè)梯度。測定前水浴保溫30 min，其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.3.2 pH值對(duì)LOX活力的影響

在優(yōu)化的溫度條件下選擇0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.2節(jié)。在此梯度下的最適pH值周圍設(shè)置更小的pH值梯度進(jìn)行再次驗(yàn)證，以確定最佳反應(yīng)pH值。

1.3.3.3磷酸鹽緩沖液濃度對(duì)LOX活力的影響

在優(yōu)化的溫度及磷酸鹽緩沖液pH值條件下，設(shè)置磷酸鹽緩沖液濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.4花生發(fā)芽過程中LOX活力測定

參照Uwaegbute等[25]的方法，根據(jù)花生的發(fā)芽特性，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)做出部分修改?；ㄉN子經(jīng)過篩選、除雜后，于體積分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 min，后每隔10 min用去離子水沖洗，沖洗數(shù)次后于30℃條件下黑暗浸泡12 h，用去離子水潤洗數(shù)次后置于發(fā)芽機(jī)中于培養(yǎng)箱中30℃黑暗條件下發(fā)芽，每隔24 h換水一次，發(fā)芽時(shí)間共96 h，每隔12 h取樣，液氮速凍，存于-20℃冰箱中備用。將種胚芽和子葉剝離，測定不同發(fā)芽時(shí)間花生種子不同部位的LOX活力。蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)定P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1花生LOX活力測定方法的優(yōu)化

2.1.1酶活力測定時(shí)間范圍的確定

圖1 OD 1 OD234nm34nm隨時(shí)間的變化Fig.1 Curve showing absorbance at 234 nm as a function of reaction time

由圖1可知，花生LOX促反應(yīng)曲線屬于典型的“S”型曲線，前20 s是酶促反應(yīng)啟動(dòng)階段，OD234nm在此時(shí)間段內(nèi)略有波動(dòng)，20 s后酶液與底物充分接觸后開始呈直線上升，反應(yīng)開始150 s后酶促反應(yīng)趨于平緩直至停止，因其在60～120 s期間OD234nm上升速率最大，在此時(shí)間范圍內(nèi)OD234nm上升幅度均可以準(zhǔn)確代表酶活力大小。因此，本實(shí)驗(yàn)確定60～120 s為花生LOX活力的測定時(shí)間。

圖2 溫度對(duì)LOX活力的影響Fig.2 Effect of temperature on LOX activity

2.1.2溫度對(duì)LOX活力的影響

由圖2可知，花生LOX活力隨著反應(yīng)溫度的升高，整體呈先升高后下降的趨勢。在未達(dá)到酶的反應(yīng)最適溫度前，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系中酶的活化分子數(shù)增多，酶活力增加。在26～36℃酶活力較高，中間略有波動(dòng)，在26℃和32℃時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)峰頂，酶活力顯著高于其他溫度下的酶活力，這可能是因?yàn)榛ㄉ胁煌っ傅淖钸m溫度不同所致。其后LOX活力隨著溫度的升高而降低，可能是因?yàn)樵谳^高的溫度下，酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶分子內(nèi)部的有序排列受到破壞，導(dǎo)致酶活性降低[26]。王輝等[27]指出，大豆的LOX在體外的耐熱性不高，在40℃保溫30 min的酶活力只有在30℃保溫30 min酶活力的50%。在32℃條件下LOX活性最高，因此酶活力測定體系中溫度選擇32℃。

2.1.3磷酸鹽緩沖液pH值對(duì)LOX活力的影響

圖3 磷酸鹽緩沖液pH值對(duì)LOX活力的影響Fig.3 Effect of buffer solution pH on LOX activity

前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)，LOX在pH 6.5處酶活力最高。為進(jìn)一步確定LOX的最適pH值，在pH 5.8～7.0之間重新設(shè)置了6個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。pH值的變化會(huì)引起酶分子中活性必需基團(tuán)解離狀態(tài)的變化，影響酶分子與底物的結(jié)合。由圖3可知，LOX活力隨磷酸鹽緩沖液pH值升高呈現(xiàn)整體先上升后下降的趨勢，在pH 6.8處酶活力最高，所以酶活力測定體系中選擇磷酸鹽緩沖液pH值為6.8。

2.1.4磷酸鹽緩沖液濃度對(duì)LOX活力的影響

圖4 磷酸鹽緩沖液濃度對(duì)LOX活力的影響Fig.4 Effect of phosphate buffer solution concentration on LOX activity

緩沖液的濃度是影響酶催化活性的因素之一，由圖4可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度太高或太低時(shí)都會(huì)影響酶的催化效率，磷酸鹽緩沖液濃度在0.10 mol/L時(shí)LOX活力顯著高于其他濃度下的酶活力，所以酶活力測定體系中選擇磷酸鹽緩沖液濃度為0.10 mol/L。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出花生中LOX活力測定體系的條件：反應(yīng)溫度32℃，磷酸鹽緩沖液pH 6.8，磷酸鹽緩沖液濃度0.10 mol/L，此條件下LOX酶活力達(dá)12.23U/mg pro。侯美玲等[24]對(duì)“花育22號(hào)”中提取的LOX最適反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，認(rèn)為在pH 5.7、32℃、緩沖液濃度為0.10 mol/L的條件下顯示出最佳酶活力。

2.2發(fā)芽過程中花生LOX活力的變化

圖5 全?；ㄉ鶯OX活力隨發(fā)芽時(shí)間的變化Fig.5 Curve showing LOX activity in peanut as a function of germination time

由圖5可知，花生LOX活性隨發(fā)芽時(shí)間的延長呈先下降后上升再下降又緩慢上升的變化趨勢。發(fā)芽36 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大，約為初始種子中酶活力的1.11倍。在發(fā)芽過程中，脂類物質(zhì)在LOX和脂肪酶的作用下不斷發(fā)生降解，為種子萌發(fā)和幼苗生長提供能量來源?；ㄉN子在發(fā)芽24～36 h時(shí)處于旺盛期，LOX活力上升，可能是因?yàn)樵诜N子萌發(fā)的早期階段種子體內(nèi)各種酶被啟動(dòng)，參與調(diào)節(jié)或觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)過程，酶反應(yīng)開始變得劇烈[28]。此后酶活力降低；中間60～72 h期間略有上升趨勢，可能是因?yàn)榛ㄉ鶯OX幾種同工酶在不同發(fā)育階段表達(dá)的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)在大豆某些發(fā)育階段中會(huì)產(chǎn)生新的LOX同工酶[29]。

2.3發(fā)芽過程花生胚芽中LOX活力的變化

圖6 花生胚芽中LOX活力隨發(fā)芽時(shí)間的變化Fig.6 Change in LOX activity in peanut embryo during germination

如圖6所示，花生胚芽中LOX活性變化同全?；ㄉ诎l(fā)芽初期相似，在12～24 h范圍內(nèi)顯著下降，發(fā)芽36 h時(shí)，胚芽中LOX活力達(dá)到最大為8.1 U/mg pro，此趨勢和全?；ㄉ忻富盍ψ兓厔菀嘞嗤?。發(fā)芽后期酶活力也迅速下降，并在隨后的發(fā)芽過程中維持較低的水平，約為初始酶活力的10%。

2.4發(fā)芽過程花生子葉中LOX活力的變化

圖7 花生子葉LOX活力隨發(fā)芽時(shí)間的變化Fig.7 Change in LOX activity in peanut cotyledon during germination

如圖7所示，在發(fā)芽初始至24 h期間，花生子葉中的LOX活力呈下降趨勢。隨著發(fā)芽的進(jìn)行（24～36 h），種子吸脹完成，LOX的活力上升，子葉中LOX在發(fā)芽36 h時(shí)酶活力最大為63.10 U/mg pro，比未發(fā)芽種子（0 h）增加了約13%?；ㄉ尤~中含有大量油脂，主要是油酸和亞油酸，在花生萌發(fā)過程中，油脂作為主要的儲(chǔ)能物質(zhì)，在LOX和脂肪酶的作用下，分解為小分子物質(zhì)并提供能量[30]。子葉部位中的LOX活力略高于全粒種子，這可能與此期間子葉中的LOX被激活和脂肪反應(yīng)提供種胚發(fā)育所需的能量和營養(yǎng)有關(guān)；在水稻研究中也有類似報(bào)道[31]。已有的研究表明，大豆LOX同工酶隨植株發(fā)育而產(chǎn)生較大變化，吸脹結(jié)束后在幼嫩快速生長的組織中通常都表現(xiàn)出很高的酶活性[32-33]。

表1 花生發(fā)芽過程中全粒、子葉和胚芽中LOX活力的相關(guān)性分析Table 1 Correlation of LOX activity in different parts of peanut during germination

變量之間顯著性值小于0.001，表示其相應(yīng)的兩個(gè)變量極顯著相關(guān)。由表1可知，全?；ㄉ鶯OX活力和花生子葉LOX活力以及花生胚芽LOX活力均極顯著相關(guān)，全?；ㄉ鶯OX活力與花生子葉LOX活力的相關(guān)系數(shù)高于全粒花生LOX活力與花生胚芽LOX活力的相關(guān)系數(shù)?；ㄉ尤~LOX活力和花生胚芽LOX活力極顯著相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)最小。LOX主要存在花生子葉中，在花生發(fā)芽過程中，子葉中的LOX起主要作用。

3 結(jié) 論

花生中LOX活力測定的最佳反應(yīng)體系是：磷酸鹽緩沖液濃度0.10 mol/L，pH 6.8，溫度32℃，此條件下LOX酶活力達(dá)12.23 U/mg pro。花生發(fā)芽過程中無論在子葉還是胚芽中，LOX活力均在36 h達(dá)到最大值，分別為63.10 U/mg pro和8.1 U/mg pro，且均顯著高于其他發(fā)芽時(shí)期。LOX活力在36 h后呈下降趨勢，胚芽中LOX酶活力比全粒LOX酶活力下降速率更快。根據(jù)花生發(fā)芽過程中全粒、子葉以及胚芽中LOX活力的相關(guān)性分析，顯示全?；ㄉ富盍εc子葉和胚芽中酶活力極顯著相關(guān)，并且全粒與子葉中LOX活力相關(guān)性大于其與胚芽中LOX活力的相關(guān)性。

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Change in Lipoxygenase Activity in Peanut during Germination

ZHANG Yajun, YANG Xuan, YANG Zhen, HAN Yongbin*
(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Lipoxygenase has been considered one of the most critical enzymes in lipid degradation, and it has positive or adverse impact on nutrients in foods. In this study, the cultivar “HUAYU 30” was used to establish a lipoxygenase activity assay system for peanuts. The optimal reaction conditions were determined as 32 ℃, pH 6.8 and 0.10 mol/L phosphate buffer by single factor experiments. Under these conditions, the change in lipoxygenase activity during peanut germination was studied. The results showed that lipoxygenase activity was the highest after germination for 36 h, and then decreased with a slight fl uctuation during peanut germination. The lipoxygenase activity in embryo was lower than in cotyledon, but they both showed the same trend as the whole peanut.

peanut; germination; lipoxygenase

S565.2

1002-6630（2015）09-0182-05

10.7506/spkx1002-6630-201511035

2014-08-04

張雅君（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：2012108024@njau.edu.cn

*通信作者：韓永斌（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：hanyongbin@njau.edu.cn