有機白蘿卜 表皮附生乳酸菌抗生素耐藥性分析

林 凱，蔡 婷，徐顧榕，宋菲菲，袁春紅，陳 功，向文良,*，張 慶

有機白蘿卜 表皮附生乳酸菌抗生素耐藥性分析

林 凱1，蔡 婷1，徐顧榕1，宋菲菲1，袁春紅1，陳 功2，向文良1,*，張 慶1

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川省食品生物技術(shù)重點實驗室，
四川 成都 610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川 成都 611130）

以市售有機白蘿卜為研究對象，分析其表皮附生乳酸菌對四環(huán)素（tetracycline，TET）、鏈霉素（streptomycin，STR）和青霉素G（penicillin G，PEN）的耐藥性。分離菌株的生理生化特征、隨機擴增多態(tài)性DNA聚類（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、16S rRNA、耐藥性和耐藥表型多態(tài)分析表明：有機白蘿卜表皮附生有約4.67×103CFU/cm2的乳酸菌。分離的187株乳酸菌分別屬于Pediococcus pentosaceus（114/187）、Weissella cibaria（9/187）、Leuconostoc mesenteroides（18/187）、Leuconostoc pseudomesenteroides（7/187）、Leuconostoc citreum（20/187）和Leuconostoc holzapfelii（19/187）。其中，25株（13.37%）對TET、STR和PEN表現(xiàn)出單一或多重耐藥性。在P. pentosaceus中，分別有2株對STR、TET和PEN三重耐藥，13株對STR和TET二重耐藥和4株對TET單一耐藥；L. citreum中，分別有1株對STR、TET和PEN三重耐藥和1株對STR單一耐藥；L. mesenteroides中，分別有1株對TET單一耐藥和1株對TET和PEN二重耐藥；L. pseudomesenteroides和W. cibaria中，分別有1株對STR和TET、STR和PEN二重耐藥。

有機白蘿卜；乳酸菌；四環(huán)素；鏈霉素；青霉素G；耐藥性

隨著生活水平逐步提高，人們越來越重視食品安全問題。有機蔬菜純天然、不含任何農(nóng)藥殘留，通常被稱為“零污染”蔬菜，因此備受消費者青睞[1]。然而，近年來，隨著抗生素耐藥性對環(huán)境面源污染的加劇，曾經(jīng)被認為“零污染”的有機蔬菜中也發(fā)現(xiàn)了抗生素耐藥性，為有機蔬菜的食品安全性帶來了新的挑戰(zhàn)[2]?？股啬退幮宰鳛橐环N新型的污染類型由美國學(xué)者Pruden[3]于2006年首先提出，由于抗生素在環(huán)境介質(zhì)中的持久性殘留以及在不同宿主間的傳播往往比抗生素本身危害更大，因此其對公共健康和食品安全構(gòu)成的威脅使其目前已成為植物學(xué)、土壤學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[4-6]。

抗生素在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的大量使用或濫用造成抗生素殘留對動物腸道微生物的耐藥性選擇和誘導(dǎo)是環(huán)境抗生素耐藥性面源污染的重要來源，也是有機食物蔬菜通過動物糞便等有機肥污染抗生素耐藥性的重要原因[4-5,7]。研究發(fā)現(xiàn)，從20世紀30年代抗生素被發(fā)現(xiàn)開始，隨著抗生素使用量逐漸增加，土壤微生物對常用抗生素的耐藥性明顯增加[5]。施用奶牛場有機肥的土壤中有70%的抗生素抗性基因被誘導(dǎo)[8-9]，對家畜糞便、河流、灌溉渠、土壤和空氣中的微生物宏基因組研究，發(fā)現(xiàn)了16種四環(huán)素抗性基因、3種磺胺類抗性基因、10種β-內(nèi)酰胺類抗性基因[5,10-12]。有機蔬菜種植過程中，攜帶有這些耐藥基因的菌株不可避免地會附著在蔬菜表面，為有機蔬菜特別是鮮食有機蔬菜的食品安全帶來潛在風險。

白蘿卜（Raphanus sativusL.）是一種常見的 根莖類蔬菜，屬十字花科、蘿卜屬的一年或二年生草本雙子葉植物[13]。我國白蘿卜栽培歷史悠久，是一種藥食同源的大眾化蔬菜，富含VC、芥子油、淀粉酶和粗纖維，具有促進消化、增強食欲、加快胃腸蠕動和止咳化痰的作用，可以治療或輔助治療多種疾病，為食療佳品，被本草綱目稱為“蔬中最有利者”，因此常被作為水果而鮮食[13]。乳酸菌是蔬菜表面常見的附生微生物，長期以來被普遍認為是安全[14]。然而，近年來發(fā)現(xiàn)越來越多抗生素耐藥乳酸菌具有一定可轉(zhuǎn)移耐藥性，為乳酸菌的安全敲響了警鐘。那么，通過有機種植的白蘿卜表皮是否附生著抗生素耐藥性乳酸菌呢？國內(nèi)外目前鮮有對此方面的報道。因此，本研究以成都平原有機種植的白蘿卜為研究材料，分析其表皮附生的四環(huán)素（tetracycline，TET）、鏈霉素（streptomycin，STR）和青霉素G（penicillin G，PEN）耐藥性乳酸菌，并評估其耐藥性，以期為有機白蘿卜鮮食的食品安全評價提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

有機白蘿卜樣品，購于成都某有機蔬菜種植基地零售超市。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基和改良MRS瓊脂培養(yǎng)基（含0.75%的CaCO3）均按文獻[15]方法配制。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與生化特征分析

隨機選取有機白蘿卜表皮10 g（外表面積約40 cm2），加入到裝有90 mL無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用Bagmixer拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。取適量均質(zhì)液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于改良MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)48 h。選取菌落適宜的平板，挑取有明顯溶鈣圈的菌落于MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線純化2次，純化后的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移至30%的無菌甘油凍藏管中，-20℃保存?zhèn)溆?。菌株的生理生化特征按《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[15]中的鑒定方法進行。

1.2.2隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）聚類分析

分離菌株的基因組D N A提取和R A P D聚類分析參見Xiang Wenliang等[16]的方法。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增采用引物G1：5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’和L1：5’-CAAGGCATCCACCGT-3’。PCR擴增條件：94℃變性1 min，55℃退火2 min，72℃延伸3 min，25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）后條帶經(jīng)LabImage 2.7.1識別并轉(zhuǎn)化成0/1矩陣，采用NTSYS PC 2.11做非加權(quán)組平均法（unweighited pair group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類分析[17-18]。

1.2.3 16S rRNA序列分析

分離菌株的16S rRNA擴增及序列分析參見Xiang Wenliang等[19]的方法。采用細菌16S rRNA通用引物Eu27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和原核微生物特異性引物1490R：5’-GGTTACCTTG TTACGACTT-3’。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72℃保持10 min。PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體后克隆入感受態(tài)細胞E. coliDH5α中，篩選陽性克隆子，提取重組質(zhì)粒對16S rRNA測序，無嵌合體的序列用CLASSIFIER（RDPII，http://rdp.cme.msu.edu./ classifier/classifier.jsp）軟件與RDP數(shù)據(jù)庫中的模式菌株進行相似性比較，確定菌株的分類地位。

1.2.4抗生素耐藥性分析

依據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感委員會（http://www. eucast.org）關(guān)于微生物對不同抗生素敏感閾值X的數(shù)據(jù)庫（http://www.eucast.org/mic_distributions/），分析菌株的抗生素耐藥性。當分離菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤X時為敏感性菌株，反之當MIC＞X時為耐藥性菌株。

MIC測定采用微量肉湯稀釋法[20]。分別將TET、STR和PEN配制成2 048μg/mL的貯存液，MRS液體培養(yǎng)基2倍梯度稀釋成使用液。STR的梯度稀釋質(zhì)量濃度為2～1 024μg/mL，TET和PEN的梯度稀釋質(zhì)量濃度為1～512μg/mL。向96孔板中加入198μL含不同濃度抗生素的MRS液體培養(yǎng)基后，接種2μL分離菌株的培養(yǎng)液（1×107CFU/mL），37℃靜止培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計不同菌株的MIC，每組實驗重復(fù)3次并設(shè)置空白對照。

1.2.5耐藥表型的多態(tài)性分析

以耐藥菌株對TET、STR和PEN的抗生素敏感最高閾值X為起始點，不同菌株的MIC為終止質(zhì)量濃度，設(shè)置不同的質(zhì)量濃度梯度，統(tǒng)計分離株在各質(zhì)量濃度下的生長情況，將各種質(zhì)量濃度下“耐藥”賦值為“1”、“敏感”賦值為“0”，構(gòu)建分離菌株抗生素耐藥表型的“0”和“1”的矩陣。利用NTSYS PC 2.11軟件做UPGMA聚類分析[17-18]，并以各分離株的MIC構(gòu)建點陣圖，分析有機白蘿卜表皮附生乳酸菌對抗生素的耐藥表型多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株的分離及生化特征

表1 有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的生理生化特征TTaabbllee 11 PPhhyyssiioolloogical and biochemical characteristics of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

乳酸菌是指發(fā)酵時能夠產(chǎn)生乳酸的一大類細菌，包括40個屬，近300個種。MRS平板分離乳酸菌時，利用其產(chǎn)生的乳酸溶解CaCO3形成溶鈣圈的特性，實現(xiàn)乳酸菌的初步分離。在當前研究中，10 g蘿卜表皮樣品（外表面積約40 cm2）在稀釋度為10-3、接種100μL時，平板上出現(xiàn)了187個溶鈣圈菌落，表明有機白蘿卜表面附生乳酸菌的量約4.67×103CFU/cm2。依據(jù)能否利用糖和醇的特征，這些菌株被分成6個簇群（表1），其中，菌株LCB005代表的簇群最大，約占有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的61%；菌株LCB035代表的簇群最小，僅占3.7%。

2.2 RAPD多態(tài)性聚類分析

利用RAPD技術(shù)對187株有機白蘿卜表皮附生乳酸菌進行聚類分析發(fā)現(xiàn)：引物G1和L1的PCR隨機擴增圖譜表現(xiàn)出了明顯的多態(tài)性，其條帶通過NTSYS軟件的UPGMA法聚類后分為6個簇群（圖1）。其中，有114株與LCB005的圖譜一致，與LCB020、LCB035、LCB066、LCB147和LCB178的圖譜一致的菌株分別有18、7、20、19、9株。RAPD聚類表現(xiàn)出了與表1一致的分類關(guān)系，揭示了有機白蘿卜表皮附生的乳酸菌有6個簇群。

圖1 有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的RAPD分型及聚類分析Fig.1 RAPD typing and cluster analysis of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

2.3 16S rRNA分析

Stackebrandt等[21]認為：當細菌16S rRNA序列同源性≥97%時可以認為是一個屬，序列同源性≥98%時則可以認為是一個種。為進一步確定有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的分類學(xué)地位，上述6個簇群中，＜10株的簇群隨機選取5株，10～20株的簇群隨機選取10株，＞100株的簇群隨機選取30株進行16S rRNA序列分析。結(jié)果表明：有機白蘿卜表皮的附生乳酸菌主要屬于Weissella、Leuconostoc和Pediococcus屬（表2）。其中，LCB005代表的114株分離株屬于Pediococcus屬，隨機選取的30株菌的16S rRNA序列與P. pentosaceusDSM 20336T的16S rRNA序列相似性皆為99%（表2），這些菌株對糖或醇的利用與DSM 20336T一致（表2），因此LCB005群被鑒定為P. pentosaceus，占61.0%。LCB178代表的9株菌屬于Weissella屬，隨機選取的5株菌的16S rRNA序列與W. cibariaLMG 17699T的16S rRNA序列相似性為100%（表2）。在糖或醇的利用方面，LCB178群與LMG 17699T一致（表2），因此被鑒定為W. cibaria，占所有附生乳酸菌的4.8%。其他64株乳酸菌均屬于Leuconostoc屬，LCB020、LCB035、LCB066和LCB147群中所分析菌株的16S rRNA序列分別與L. mesenteroidesATCC 8293T、L. pseudomesenteroidesNRIC 1777T、L. citreumATCC 49370T和L. holzapfeliiLMG 23990T的16S rRNA序列相似性為99%（表2），對糖或醇的利用也分別與各自簇群的相似菌株相同。因此，LCB020、LCB035、LCB066和LCB147群分別鑒定為L. mesenteroides（9.6%）、L. pseudomesenteroides（3.7%）、L. citreum（10.7%）和L. holzapfelii（10.2%）。

表2 有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的分類地位與群落構(gòu)成Table 2 Community structure and classification of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

2.4 抗生素耐藥性分析

表3 有機白蘿卜表皮附生的部分乳酸菌對TET、STR和PEN的MIC與耐藥性Table 3 TET,STR and PEN antibiotic resistance and MICs for eppibiotic lactc acid bacteria on the surface of organic white radish

在187株蘿卜表皮附生乳酸菌中，除L. holzapfelii種的分離株未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株外，其他5個種中共計有25株菌的MIC＞歐洲抗微生物藥物敏感委員會規(guī)定的閾值X（表3），約占分離菌株的13.37%。在114株P(guān). pentosaceus菌株中，有19株（10.16%）表現(xiàn)出了抗生素耐藥，其中有4株（2.14%）表現(xiàn)出對TET的單一耐藥，13株（8.02%）表現(xiàn)出對TET和STR的二重耐藥，有2株（1.07%）同時表現(xiàn)出了對TET、STR和PEN的三重耐藥（表3）；此外，9株L. citreum中，也有1株（0.53%）同時表現(xiàn)出對TET、STR和PEN的三重耐藥（表3）。在18株L. mesenteroides中，分別有1株（0.53%）表現(xiàn)出對TET的單一耐藥、1株（0.53%）表現(xiàn)出對TET和PEN的二重耐藥（表3）。在7株L. pseudomesenteroides和9株W. cibaria中，分別有1株（0.53%）表現(xiàn)出對STR和TET、STR和PEN的二重耐藥。總體而言，分離菌株對抑制細胞壁合成的PEN比抑制蛋白合成的STR和TET更敏感，且部分菌株表現(xiàn)出多重耐藥。

2.5耐藥性表型的多態(tài)性分析

圖2 有機白蘿卜表皮附生乳酸菌對TET、STR和PEENN的耐藥表型多態(tài)性分析Fig.2 Phenotype polymorphism of TET, STR and PEN antibiotic resistance of lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

NTSYS聚類發(fā)現(xiàn)：有機蘿卜表皮附生的TET、STR和PEN耐藥性乳酸菌對同一種抗生素具有不同的MIC；多數(shù)耐藥性乳酸菌表現(xiàn)出了多重耐藥，只有少數(shù)菌株僅對1種抗生素具有耐藥性（圖2）。所有分離的耐藥性乳酸菌中，P. pentosaceusLCB122、P. pentosaceusLCB126和L. citreumLCB068對3種抗生素表現(xiàn)出多重耐藥（圖2）；L. citreumLCB066和P. pentosaceusLCB018、P. pentosaceusLCB030、P. pentosaceusLCB085、P. pentosaceusLCB105、L. mesenteroidesLCB165分別對STR和TET表現(xiàn)單一耐藥（圖2）；在二重耐藥性菌株中，除W. cibariaLCB178和L. mesenteroidesLCB141分別對STR和PEN、TET和PEN表現(xiàn)出二重耐藥外，其他二重耐藥菌株均表現(xiàn)出對STR和TET的二重耐藥。所有耐藥菌株的MIC均高出相應(yīng)抗生素敏感閾值X多倍，表現(xiàn)出了較強的耐藥性，其中P. pentosaceusLCB122的耐藥性最強，其對TET、STR和PEN的MIC分別達到512μg/mL（閾值X=8μg/mL）、＞1 024μg/mL（X=64μg/mL）和512μg/mL（X=4μg/mL）。

3 結(jié) 論

有機蔬菜的種植和產(chǎn)品認定有著嚴格的質(zhì)量標準，因此被認為是最安全的蔬菜。然而，這些標準通常只關(guān)注與蔬菜質(zhì)量和有機特性相關(guān)的一些指標，如：種植過程、產(chǎn)品風味、營養(yǎng)和健康等，很少注重有機蔬菜的微生物，特別是抗生素耐藥性指標[2]。當前對有機白蘿卜表皮附生乳酸菌的研究表明：有機白蘿卜表面附生乳酸菌的量約為4.67×103CFU/cm2，這些菌主要屬于P. pentosaceus（61.0%）、W. cibaria（4.8%）、L. mesenteroides（9.6%）、L. pseudomesenteroides（3.7%）、L. citreum（10.7%）和L. holzapfelii（10.2%）。隨著抗生素耐藥性對環(huán)境面源污染的加劇，有機白蘿卜表皮附生的乳酸菌中也出現(xiàn)了耐藥性。在187株乳酸菌分離株中，除L. holzapfelii未發(fā)現(xiàn)耐藥性外，其他種中均出現(xiàn)了TET、STR和PEN的耐藥菌株（13.37%）。其中，多數(shù)TET、STR和PEN的耐藥乳酸菌表現(xiàn)出多重耐藥，只有少數(shù)單一耐藥。在P. pentosaceus中，分別有2株對STR、TET和PEN表現(xiàn)出三重耐藥、13株對STR和TET表現(xiàn)出二重耐藥和4株對TET表現(xiàn)出單一耐藥；L. citreum中，分別有1株對STR、TET和PEN三重耐藥和1株對STR單一耐藥；L. mesenteroides中，分別有1株對TET單一耐藥和1株對TET和PEN二重耐藥；W. cibaria中有1株對STR和PEN二重耐藥；L. pseudomesenteroides中有1株對STR和TET二重耐藥。這些耐藥菌株對同一種抗生素具有不同的MIC，所有耐藥菌株的MIC均高出相應(yīng)抗生素敏感閾值X多倍，表現(xiàn)出了較強的耐藥性，其中P. pentosaceusLCB122的耐藥性最強，其對TET、STR和PEN的MIC分別達到512、＞1 024、512μg/mL。有機白蘿卜表皮發(fā)現(xiàn)的抗生素耐藥性為鮮食有機白蘿卜的食品安全埋下了隱患。因此，需建立有機白蘿卜表皮附生抗生素耐藥乳酸菌的檢測與防控體系，確保有機白蘿卜的食品安全，維護廣大消費者的健康權(quán)益。

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Antibiotic Resistance of Epibiotic Lactic Acid Bacteria on the Surface of Organic White Radish

LIN Kai1, CAI Ting1, XU Gurong1, SONG Feifei1, YUAN Chunhong1, CHEN Gong2, XIANG Wenliang1,*, ZHANG Qing1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, Institute of Ancient Brewing Technology, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Academy of Food & Fermentation Industries, Chengdu 611130, China)

The epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, physiological and biochemical characteristics, RAPD, 16S rRNA, antibiotic resistance and phenotype polymorphism. Approximately 4.67 × 103CFU/cm2LAB including 187 isolates colonized on the surface of organic white radish. These isolates were assigned toPediococcus pentosaceus(114/187),Weissella cibaria(9/187),Leuconostoc mesenteroides(18/187),Leuconostoc pseudomesenteroides(7/187),Leuconostoc citreum(20/187) andLeuconostoc holzapfelii(19/187), respectively. And 25 (13.37%) isolates displayed single-drug or multi-drug resistance to tetracycline (TET), streptomycin (STR) and penicillin G (PEN). Of theseP. pentosaceusisolates, 2 had triplicate resistance to STR, TET and PEN, 13 had double resistance to TET and STR, and 4 had single resistance to STR. Of theseL. citreumisolates, 1 had triplicate resistance to STR, TET and PEN, and 1 had the solo resistance to STR. Furthermore, 2L. mesenteroidesisolates with TET resistance and double resistance TET and PEN respectively were found, and on the surface of white radish there were 1L. pseudomesenteroidesstrain and 1W. cibariastrain showing double resistance to STR and TET and double resistance to STR and PEN, respectively.

organic white radish; lactic acid bacteria; tetracycline; streptomycin; penicillin G; antibiotic resistance

TS201.3

1002-6630（2015）11-0145-05

10.7506/spkx1002-6630-201511028

2014-07-29

教育部春暉計劃項目（Z2014061）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2014JY0045）；四川省教育廳重點項目（14ZA0110）；四川省泡菜產(chǎn)業(yè)鏈項目（2012NZ0002-8）；四川省食品生物技術(shù)重點實驗室項目（SZJJ2014-007）

林凱（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物分子生態(tài)。E-mail：biokailin@sina.com

*通信作者：向文良（1973—），男，副教授，博士，研究方向為中國西南地區(qū)特色發(fā)酵食品微生物分子生態(tài)與生物過程學(xué)。E-mail：xwllm7687@sina.com