傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

謝 婕，趙 欣，騫 宇，李 鍵，陳煉紅，陳 娟，索化夷,*

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

謝 婕1,2，趙 欣3，騫 宇3，李 鍵4,5，陳煉紅4,5，陳 娟5，索化夷1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；5.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

通過提取羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中分離到的36株酵母菌的基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增其26S rDNA并測定序列，將序列輸入GenBank中通過基本局部序列檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）檢索確定種屬（同源性≥99%）。結(jié)果表明：傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌主要為馬克斯克魯維酵母17株（47.2%）、釀酒酵母6株（16.7%）、平常假絲酵母5株（13.9%）、喜仙人掌畢赤酵母4株（11.1%）、發(fā)酵畢赤酵母3株（8.3%），1株鑒定失敗。并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)合分子鑒定結(jié)果分析酵母菌的遺傳多樣性。

牦牛酸乳；酵母菌；基因組DNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；26S rDNA

牦牛在我國主要分布于青藏高原地區(qū)，是高原地區(qū)牧民主要生產(chǎn)生活資料，素有萬能畜種之稱[1]。牦牛乳本身營養(yǎng)價值極高，是天然的綠色產(chǎn)品，經(jīng)乳酸菌、酵母菌等作用發(fā)酵成牦牛酸乳，使其具有多種保健功能。藏民多年來一直保留著手工制作牦牛酸乳的習(xí)俗，他們以高原新鮮牦牛乳為原料[2]，以傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作出口味獨特的牦牛酸乳，深受藏民的喜愛。牦牛酸乳發(fā)酵過程中的酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值，特別是含有較多蛋白質(zhì)、VB、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些具有保健功能的活性物質(zhì)。然而在市售酸奶中酵母菌往往被認(rèn)為是酸奶中的污染菌，引起酸奶變質(zhì)。相反在一些Ⅳ型發(fā)酵乳中，如牦牛酸乳、開菲爾發(fā)酵乳，酵母菌卻能夠為產(chǎn)品帶來期望的香氣和風(fēng)味[3-4]。吳陽[5]研究賽里木酸奶中酵母菌篩選鑒定及發(fā)酵特性，表明馬克斯克魯維酵母菌和瑞士乳桿菌可以共同在牛乳中發(fā)酵生長，并且各自產(chǎn)生了期望的風(fēng)味物質(zhì)，但需要進行更進一步的實驗去證明兩者的相容性。于嵐等[6]在對開菲爾粒中發(fā)酵優(yōu)勢菌混合發(fā)酵生產(chǎn)開菲爾飲品的研究中發(fā)現(xiàn)利用酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵能有效提高牛奶中脂肪的降解率。譚鋒等[7]從開菲爾粒中分離出兩株生長發(fā)酵旺盛的酵母菌，發(fā)現(xiàn)乳酸菌與酵母菌的比例對發(fā)酵產(chǎn)品的感官風(fēng)味影響最為顯著，其次是加糖量。羅珍蘭[8]發(fā)現(xiàn)酵母菌在其生長代謝、繁殖過程中，同時產(chǎn)生促進其他細菌生長的生長素類物質(zhì)，因而在開菲爾粒中，酵母菌在促進微生物之間的共生作用以及二氧化碳的形成、提高特殊風(fēng)味和香氣方面起重要作用。

酵母菌種屬的界定主要是依靠形態(tài)學(xué)和生理生化特性，包括根據(jù)這些表型特征而發(fā)展起來的各種商業(yè)上的酵母菌快速檢測試劑盒。但某些酵母菌的種屬在形態(tài)學(xué)及生理生化特性方面差異并不顯著。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核糖體DNA序列分析[9]等分子生物學(xué)鑒定方法使用愈加普遍。本實驗以分離純化自羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的36株酵母菌為材料，通過提取酵母總DNA、特定序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增、序列測定再至GenBank檢索進行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析其遺傳多樣性。通過分離鑒定牦牛酸乳中的酵母菌來研究其種類多樣性，既有潛在的市場價值，也為研究高原地區(qū)獨特自然發(fā)酵乳中的微生物區(qū)系組成、建立牦牛酸乳酵母菌菌種資源庫打下基礎(chǔ)。目前國內(nèi)對牦牛酸乳中酵母菌資源的收集篩選、分類鑒定、菌種穩(wěn)定性和安全性評估研究也還相對較少。因此，對藏區(qū)自然發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌進行收集篩選和鑒定，對我們進一步認(rèn)識利用并開發(fā)出具有自主產(chǎn)權(quán)的牦牛酸乳發(fā)酵劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

牦牛酸乳采自西藏羊八井地區(qū)，冰盒保藏，實驗室對其中的酵母菌進行分離純化，得到36株未知酵母，20%甘油-20 ℃條件下保存。

1.1.2儀器與試劑

BioSpec-Mini紫外分光光度計日本島津公司；S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、Mini-Sub Cell GT Cel小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)英國SynGene公司；Milli-Q超純水儀法國Millipore公司。

YPD培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；PfuDNA Polymerase（PfuBuffer含Mg2+）dNTPs Mix酵母基因組DNA提取試劑盒北京索萊寶科技有限公司；GelRed核酸染料美國Biotium公司；λDNA/HindⅢMarker、100 bp DNA Ladder Marker天根生化（北京）科技有限公司；引物NL1、NL4生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1酵母菌的活化鏡檢

將保存好的菌株無菌條件下劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)4 d，選取培養(yǎng)皿中生長完好的單菌落轉(zhuǎn)移至YPD液體培養(yǎng)基于搖床上26℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，停止培養(yǎng)。吸取YPD液體培養(yǎng)的菌液離心后將沉淀進行革蘭氏染色[10]、鏡檢。

1.2.2酵母基因組DNA提取

取1.5 mL YPD液體培養(yǎng)的菌液13 000 r/min離心1 min，棄去上清收集菌體。按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書方法提取DNA。將提取到的基因組DNA轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL EP管中，做好編號，放于-20℃冰柜保藏好備用。

1.2.3電泳和基因組DNA濃度與純度測定

1.2.3.1電泳

將提取出的DNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠質(zhì)量濃度0.8%，電壓80 V，電泳80 min，GelRed核酸染料染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察凝膠[11-12]。

1.2.3.2濃度與純度檢測

將提取的DNA樣品稀釋200倍，定容于EP管中備用。使用紫外分光光度計進行指標(biāo)檢測。

1.2.4 PCR擴增

酵母PCR擴增對象為酵母菌株的26S rRNA基因，PCR擴增體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系[[1133]]Table 1 PCR reaction system composition[[1133]]

調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合液稍加混勻、離心，置PCR儀上，執(zhí)行擴增。擴增循環(huán)程序為：95℃，5 min；94℃，1 min，52℃，1 min；72℃，1 min，共36個循環(huán)；72℃，8 min。反應(yīng)結(jié)束后，所得產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠80 V電壓電泳1 h，并作空白對照，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序、鑒定

經(jīng)1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，將保存好的PCR產(chǎn)物送往上海生工武漢測序部進行36株酵母菌26S rDNA的測序，將測序結(jié)果輸入www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST檢索GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列的同源性分析，確定其種屬。

1.2.6系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建

調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的10株酵母菌的相同區(qū)段基因序列，使用ClustalX1.83軟件進行多序列匹配比對，通過Mega5.2軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建酵母菌的同源序列系統(tǒng)進化樹，采用自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1酵母菌活化菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Yeast colony

如圖1所示，菌株劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，有單菌落出現(xiàn)，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑濕潤，顏色呈乳白色，表面凸起，邊緣整齊，不透明。

圖2 酵母菌革蘭氏染色結(jié)果（10×10000）Fig.2 Gram staining results of yeasts (10 × 100)

如圖2所示，顯微鏡下細胞染色為藍紫色，形態(tài)為圓、橢圓、卵圓等，無性繁殖方式為芽殖，一端出芽，細胞形態(tài)符合酵母菌特征。

2.2基因組DNA提取情況分析

經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈拍照得到的基因組DNA電泳條帶發(fā)現(xiàn)提取的DNA較為完整，且大小主要集中在21.2 kb左右（Marker為λDNA/HindⅢ），證實為酵母的基因組DNA。選取部分圖片如圖3所示。

圖3 6 株酵母菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of genomic DNAs of 6 yeast strains

2.3 DNA濃度與純度分析

稀釋200 倍的標(biāo)準(zhǔn)DNA質(zhì)量濃度為50μg/mL，根據(jù)微型紫外分析儀結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4 組DNA質(zhì)量濃度高出標(biāo)準(zhǔn)1 倍以上，其余32 組DNA質(zhì)量濃度均在50μg/mL左右。

純的DNA樣品的OD260nm/OD280nm為1.8，若所測比值高于1.8，則可能有RNA殘留；若低于1.8，則有可能蛋白質(zhì)殘留。36株酵母基因組DNA的OD260nm/OD280nm均在1.5附近，說明該試劑盒提取方法會有蛋白質(zhì)殘留，但未影響后續(xù)PCR擴增。

2.4 PCR擴增產(chǎn)物

酵母總DNA經(jīng)PCR擴增后得到的26S rDNA同樣經(jīng)電泳后凝膠成像拍照，如圖4所示，可知擴增產(chǎn)生的DNA片段為單一條帶，片段大小約為600 bp[14]，并且空白組無條帶出現(xiàn)，說明未出現(xiàn)污染、無非特異性擴增現(xiàn)象。

2.5測序與GenBank鑒定種屬

圖4 酵母菌PCR擴增產(chǎn)物26S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of 26S rDNA-PCR products from yeasts

PCR產(chǎn)物送由上海生工武漢測序部進行測序[15]。獲得序列通過BLAST在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的檢索結(jié)果見表2。

表2 26S rDNA序列鑒定36 株酵母菌結(jié)果Table 2 Identification of 36 yeast strains by 26S rDNA sequences

由表2可知，有3株酵母菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列具有高達100%的同源性；32株有99%的同源性；第24株的同源性只有97%，不符合鑒定要求，鑒定無效[16]?？偨Y(jié)其余35株酵母菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 35 株酵母菌的26S rDNA序列鑒定結(jié)果Table 3 Genus and species distribution of 35 yeast strains identified by 26S rrDDNNAA

2.6系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

圖5 根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列生成的36 株酵母菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 36 yeast strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences

由圖5可知，鑒定已知的35株酵母菌分為2個進化枝，表明35株酵母菌分為2個遺傳類型。馬克斯克魯維酵母（第1、4、6、8、10、13、16、18、19、20、23、25、30、31、32、33、34株）和釀酒酵母（第3、9、11、14、17、21株）處在同一分枝中，平常假絲酵母（第7、12、15、22、26株）、喜仙人掌畢赤酵母（第2、5、27、35株）和發(fā)酵畢赤酵母（第28、29、36株）處在另一分枝，表明克魯維酵母屬與酵母屬的親緣關(guān)系很近，而畢赤酵母屬與假絲酵母屬的親緣關(guān)系較近，同時因為各菌株的親緣關(guān)系與它們在進化樹中的距離呈正比，由此也可驗證26S rDNA序列鑒定法的可靠性；另外第32、19、22、27株在各自進化枝內(nèi)與其他菌株距離較遠，表明在種內(nèi)也有較高的遺傳多樣性。

綜合看來，傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的酵母菌株有著豐富的遺傳多樣性，其優(yōu)勢菌種為馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母。高原地區(qū)溫度較低，牧民家中傳統(tǒng)發(fā)酵沒有配備齊全的溫控設(shè)備，而酵母菌的最適生長溫度在28 ℃左右，因此牦牛酸乳的發(fā)酵條件適合酵母菌的生長。Bai Mei等[17]從青海地區(qū)和西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵畢赤酵母。Zhang Heping等[18]對青海地區(qū)的牦牛酸奶進行研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)牦牛酸奶中含有較多的乳酸菌和酵母菌，其中發(fā)酵畢赤酵母的分離率達到43.2%，是青海地區(qū)牦牛酸奶中的優(yōu)勢菌。王遠微等[19]從川西北地區(qū)采集到的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中均分離到了馬克斯克魯維酵母菌，由此可見馬克斯克魯維酵母是牦牛酸奶中一種常見的菌株。馬克斯克魯維酵母可以發(fā)酵分解乳糖[20]，從而降低乳糖含量，產(chǎn)生可多種羰基化合物和揮發(fā)性脂肪酸，這些芳香物質(zhì)也是牦牛酸乳具有獨特風(fēng)味的原因之一。從以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，牦牛酸乳中酵母菌發(fā)揮著很大的作用，但對于不同地區(qū)的牦牛酸乳，其優(yōu)勢菌群是不一樣的，相關(guān)文獻對西藏羊八井地區(qū)牦牛酸奶中酵母菌的優(yōu)勢菌群報道較少。牦牛酸乳與開菲爾發(fā)酵乳同屬Ⅳ型發(fā)酵乳，目前對開菲爾發(fā)酵乳中的酵母菌研究較多，陽大海等[21]對開菲爾粒中優(yōu)勢菌進行篩選鑒定，分離出9株酵母菌，分別為克魯維酵母屬2株、假絲酵母屬3株和酒香酵母屬4株，對其進行生理生化實驗結(jié)果表明，篩選得到的假絲酵母與克魯維酵母均屬于乳糖發(fā)酵型，酒香酵母屬于乳糖非發(fā)酵型。張國亮等[22]研究開菲爾粒菌相構(gòu)成，判定從開菲爾粒中分離出的7株酵母菌中的2株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），另外5株為巨大克魯維氏酵母（Kluyveromyces marxianus）。王和平等[23]發(fā)現(xiàn)開菲爾粒中通常存在有釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母馬克斯亞種、德氏有孢圓酵母、乳酒假絲酵母、酒香酵母等，優(yōu)勢菌屬為釀酒酵母。李靜等[24]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法分離鑒定發(fā)酵酸馬奶中的酵母菌，結(jié)果表明分子生物學(xué)方法準(zhǔn)確率高、重現(xiàn)性好，是一種有效的區(qū)別鑒定酵母菌的方法。

3 結(jié) 論

對采自西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的36株酵母菌進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株酵母菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列具有高達100%的同源性；32株有99%的同源性；僅有1株的同源性只有97%，鑒定無效。因此，采用26S rDNA序列分析對牦牛酸乳中酵母菌進行分子生物學(xué)鑒定，比傳統(tǒng)的方法鑒定率高，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，說明該方法對于對酵母菌株種級水平的鑒定具有很明顯的優(yōu)勢。

鑒定出的35株酵母菌共劃分為4個屬，分別是克魯維酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬；5個種，分別是馬克斯克魯維酵母（47.2%）、釀酒酵母（16.7%）、平常假絲酵母（13.9%）、喜仙人掌畢赤酵母（11.1%）、發(fā)酵畢赤酵母（8.3%）。因此，發(fā)酵牦牛酸乳中主要的酵母菌為馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母。由系統(tǒng)發(fā)育進化樹可以看出，35株酵母菌共分為2個遺傳類型?？唆斁S酵母屬與酵母屬的親緣關(guān)系很近，而畢赤酵母屬與假絲酵母屬的親緣關(guān)系較近，第32、19、22、27株菌株在其種內(nèi)有較高的遺傳多樣性。同時由進化樹的距離也可驗證26S rDNA序列鑒定法的可靠性。

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Molecular Identification of Yeasts Isolated from Traditional Fermented Yak Milk

XIE Jie1,2, ZHAO Xin3, QIAN Yu3, LI Jian4,5, CHEN Lianhong4,5, CHEN Juan5, SUO Huayi1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. School of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 4. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 5. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

The 36 yeast strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajing area were identified by PCRamplification and sequencing of 26S rDNA from their genomic DNAs and search for homologous sequences in the GenBankdatabase with Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (identity≥99%). The results showed that there were 5main yeast species identified in traditional fermented yak milk, including 17Kluyveromyces marxianusstrains (47.2%),6Saccharomyces cerevisiaestrains (16.7%),5Candida inconspicuastrains (13.9%),4Pichia cactophilastrains (11.1%),3Pichia fermentansstrains (8.3%), and one unsuccessfully identified strain. Furthermore, the phylogenetic tree of the36 yeast strains based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequences was established to analyze the genetic diversity.

yak yogurt; yeast; genomic DNA; polymerase chain reaction (PCR); 26S rDNA

TS201.3

1002-6630（2015）11-0114-05

10.7506/spkx1002-6630-201511022

2014-08-26

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203009）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃一般項目（CSTC2013JCYJA80006）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（XDJK2013B010）

謝婕（1988—），女，碩士，研究方向為發(fā)酵微生物。E-mail：15823071311@163.com

*通信作者：索化夷（1978—），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵微生物。E-mail：birget@swu.com