熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中游離氨基酸流向與乳蛋白下降的關(guān)系研究

艾 陽，曹 洋，謝正露，張?jiān)词?，沈向真

熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中游離氨基酸流向與乳蛋白下降的關(guān)系研究

艾 陽，曹 洋，謝正露，張?jiān)词?，沈向真

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

目的：探討熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中氨基酸與乳蛋白的相互關(guān)系。方法：選取6頭相同泌乳期奶牛，正常飼喂和飲水，實(shí)驗(yàn)期35 d（6月29日—8月5日）。每日10：00和18：00記錄氣溫，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)奶量，每周取全天奶樣，F(xiàn)oss乳成分分析儀檢測(cè)乳蛋白含量。于實(shí)驗(yàn)開始第1周和最后1周采集頸靜脈血液，反相高效液相色譜法檢測(cè)血液中游離氨基酸含量。結(jié)果：隨著氣溫的升高（由26℃升高至最高38℃），實(shí)驗(yàn)?zāi)膛Ｈ站a(chǎn)奶量由15.2 kg/d下降至10 kg/d，乳蛋白產(chǎn)量由0.47 kg/d下降至0.31 kg/d。血液中Glu、Asp、Gly和Val等主要的生糖氨基酸（參與糖異生作用）以及Leu、Ile等生酮氨基酸均升高或顯著升高（0.01＜P＜0.05）；總支鏈氨基酸（Val、Ile、Leu，主要參加免疫反應(yīng)）含量顯著增加（P＜0.05），在必需氨基酸中所占的 比例由54.75%增至67.89%。結(jié)論：在夏季高溫高濕條件下，奶?？砂l(fā)生熱應(yīng)激，產(chǎn)奶量和乳蛋白含量均降低，但血液中游離氨基酸，特別是支鏈氨基酸含量顯著升高。提示熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中高水平的游離氨基酸并未完全用于乳蛋白的合成，還發(fā)揮了除此之外的其他作用，而后者的作用優(yōu)先于參與乳蛋白的合成，即可能優(yōu)先作為功能性氨基酸參與了機(jī)體的其他活動(dòng)。

熱應(yīng)激；泌乳奶牛；乳；乳蛋白；血漿；游離氨基酸

熱應(yīng)激是機(jī)體處于濕熱環(huán)境下的一種非特異性反應(yīng)。許多研究表明，當(dāng)氣溫高于22℃或溫濕指數(shù)（temperature-humidity index，THI）高于72時(shí)就會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激。熱應(yīng)激會(huì)引起奶牛產(chǎn)奶量下降和乳品質(zhì)降低。研究表明，熱應(yīng)激時(shí)期乳中蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)含量均降低，且乳脂水平為一年中最低[1]。高民等[2]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可導(dǎo)致奶牛飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率下降。Shehab-El-Deen[3]、O’Brien[4]等研究認(rèn)為熱應(yīng)激可降低基礎(chǔ)循環(huán)中的葡萄糖含量，使血糖濃度顯著降低。熱應(yīng)激也會(huì)抑制細(xì)胞和體液免疫，并會(huì)誘發(fā)諸如乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下等疾病，是夏季奶業(yè)生產(chǎn)中面臨的主要問題[5-6]。近年來，隨著全球氣候變暖，熱應(yīng)激情況愈發(fā)嚴(yán)重。尤其是在高溫高濕的中國南方，熱應(yīng)激成為關(guān)鍵環(huán)境因素，嚴(yán)重制約著奶業(yè)發(fā)展。

乳蛋白是乳中總蛋白的總稱，約占乳中干物質(zhì)的90%，是構(gòu)成乳重要營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基本原料，也是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)。血液中氨基酸是乳蛋白的前體物和原料，其在血液中的含量決定著乳中蛋白質(zhì)的含量。已有文獻(xiàn)報(bào)道氨基酸適宜均衡的飼料有利于乳蛋白的合成[6]。另有研究表明氨基酸在血液中的變化反映了乳蛋白的變化，血液中氨基酸增加，乳蛋白的含量也增加[7]。因此，血液中氨基酸含量與乳蛋白合成之間的相互關(guān)系一直是備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。但目前仍未見熱應(yīng)激條件下二者關(guān)系的詳細(xì)報(bào)道。本研究通過分析研究南京地區(qū)夏季6—8月高溫高濕氣候條件下，奶牛乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)的變化，從血液中乳蛋白前體物——氨基酸代謝變化的角度探討夏季熱應(yīng)激情況下，乳蛋白下降與血液中游離氨基酸重分配間的相互關(guān)系，揭示其可能機(jī)制，以期為夏季奶牛合理飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇（2-mercaptoethanoic acid，β-ME）美國Sigma公司；甲醇（色譜級(jí)）德國默克公司；乙腈（色譜級(jí)）美國天地有限公司；四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF，色譜純）上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%，美國Holey教授饋贈(zèng)。

Foss乳成分分析儀丹麥Hillerod公司；1100型安捷倫高效液相色譜儀（配有G1311A型液相流動(dòng)泵，G1321A型紫外-可見檢測(cè)器）法國Agilent公司；WAT045905型C18色譜柱美國Waters公司；室溫檢測(cè)儀唐山現(xiàn)代工控技術(shù)有限公司；自動(dòng)擠奶機(jī)淄博博山先鋒機(jī)械廠；集乳器余姚市宇海塑料制品有限公司。

1.2動(dòng)物與飼養(yǎng)

6頭健康，體質(zhì)量（490±7）kg、分娩日期相近的泌乳期荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦畜牧獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)站（北緯32°93′，東經(jīng)119°82′）。采用Cornell-Penn-Miner System（NRC 2001）設(shè)計(jì)基礎(chǔ)日糧，飼料中青貯玉米為60%，苜蓿干草17%，精飼料23%，具體營養(yǎng)成分見表1。

飼喂期從6-8月為南京暑熱期間，維持35 d（2013年6月29日—8月5日）。6頭奶牛均飼養(yǎng)于開放式牛舍中，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，每天分別于4：00、12：00和18：00喂給飼料并于奶牛采食完成后擠奶。

表1 日糧營養(yǎng)成分Table 1 Ingredients of dietss

1.3 氣溫測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間每日氣溫紀(jì)錄采用室溫檢測(cè)儀，于上午10：00和下午18：00 2次測(cè)定，2次氣溫平均值記為每天日間氣溫。實(shí)驗(yàn)期間日間氣溫介于26～38℃之間。

1.4產(chǎn)奶量和乳成分測(cè)定

產(chǎn)奶量：每天于奶牛進(jìn)食后進(jìn)行擠奶，擠奶采用自動(dòng)擠奶機(jī)，集乳器收集后稱質(zhì)量，早中晚3次總和為每日產(chǎn)奶量。

乳蛋白含量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)期間每周周五采集全天乳樣，按體積比4∶3∶3將早、中、晚奶樣混合加入200μL飽和重鉻酸鉀作為全天乳樣，送至南京衛(wèi)崗乳業(yè)乳品檢測(cè)中心檢測(cè)。采用Foss乳成分分析儀檢測(cè)乳蛋白含量。

1.5血液樣品的采集與處理

血液樣品分別于實(shí)驗(yàn)開始（0周）和第5周采集。采集采用真空抗凝管于奶牛進(jìn)食后2 h收集每頭奶牛頸靜脈血液。采集的血液以3 000 r/ min離心15 min后，-20℃保存待測(cè)。

1.6血液中游離氨基酸的定量分析

采用OPA氨基酸柱前衍生法。反相高效液相色譜（reversed high performance liquid chromatography，RP-HPLC）儀：Kromasil C8柱；流動(dòng)相：A為甲醇，B為乙腈；C為水，D為磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含3%四氫呋喃）。梯度洗脫，程序?yàn)?0 min 9%A、6%B與85%D，10～25 min 12%A、8%B與80%D，25～40 min 15%A、15%B與70%D，40 min 30%A、25%B與45%D，直至最終洗脫完成。

樣品處理和操作方法按照張樹坤等[8]方法進(jìn)行。流速為1 mL/min，激發(fā)波長為340 nm，紫外檢測(cè)波長450 nm，進(jìn)樣量20 ?L。取樣品手工進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1乳產(chǎn)量和氣溫變化

2.1.1氣溫變化

圖1 實(shí)驗(yàn)期間每日氣溫和乳產(chǎn)量Fig.1 Average daily temperature and milk production during the experiment

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)前1周為適應(yīng)期，飼喂實(shí)驗(yàn)飼料，期間記錄每日氣溫。實(shí)驗(yàn)第1周，環(huán)境氣溫保持在26℃左右。從第2周開始，日間平均氣溫劇烈上升，總體保持在32℃以上，在總共35 d的實(shí)驗(yàn)期中，日間平均氣溫32℃以上持續(xù)時(shí)間達(dá)25 d，占實(shí)驗(yàn)總天數(shù)的68.5%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間最高溫度為38℃，共計(jì)2 d。

一般認(rèn)為THI高于72時(shí)奶牛就會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激[5]。根據(jù)THI公式和相關(guān)文獻(xiàn)[9]，當(dāng)溫度達(dá)到32℃時(shí)奶牛會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激，由此可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中參試奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

2.1.2熱應(yīng)激對(duì)乳產(chǎn)量的影響

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)開始的前2周，產(chǎn)奶量迅速降低（由15.2 kg/d降至11.2 kg/d），而這一時(shí)間內(nèi)溫度由26℃上升至36℃。實(shí)驗(yàn)中隨著熱應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展，產(chǎn)奶量不斷下降，最低為10 kg/d，僅為開始時(shí)的67%，下降了33%。乳產(chǎn)量隨著實(shí)驗(yàn)期間溫度上升總體呈下降趨勢(shì)。

2.2熱應(yīng)激對(duì)乳蛋白的影響

圖2 實(shí)驗(yàn)期間乳蛋白變化Fig.2 Milk protein changes during the experiment

如圖2所示，乳蛋白含量在實(shí)驗(yàn)前2周迅速下降，由3.08%下降至2.82%，其后3周含量又逐漸恢復(fù)至3.18%。由于在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)奶量隨時(shí)間變化和溫度的升高不斷降低，隨后又統(tǒng)計(jì)了乳中蛋白質(zhì)的實(shí)際質(zhì)量，蛋白質(zhì)的實(shí)際質(zhì)量在前3周由0.47 kg下降至0.31 kg，后2周保持在較低水平。這種含量百分比與實(shí)際質(zhì)量之間相異的變化很可能是由于在7月份的高溫天氣下，奶牛排汗增多，產(chǎn)奶量下降，乳蛋白由于濃縮而升高了其含量百分比，而乳蛋白實(shí)際質(zhì)量是降低的。

2.3熱應(yīng)激對(duì)血液中乳蛋白合成前體物氨基酸代謝流向的影響

圖3 實(shí)驗(yàn)期間氨基酸變化Fig.3 AA changes during the experiment

由圖3可知，隨著實(shí)驗(yàn)期的延長，血液中游離氨基酸中的必需氨基酸和非必需氨基酸含量均顯著增高。隨著溫度的升高，熱應(yīng)激程度的加深，除Thr以外，血液中各游離氨基酸濃度均升高，Ser、Gly、Ala、Tyr、Val、Trp、Ile和Leu顯著升高（P＜0.05），其中支鏈氨基酸（Val、Ile、Leu，主要參與免疫反應(yīng)）明顯升高（（198.37±52.58）～（1 474.85±355.83）?mol/L），從54.75%增至67.89%（P=0.024＜0.05），生酮氨基酸從（169.27±32.27）?mol/L升至（502.76±105.50）?mol/L（P=0.037＜0.05）。

3 討 論

THI是衡量熱應(yīng)激的一個(gè)重要指標(biāo)。根據(jù)已有研究結(jié)果[9]，當(dāng)溫度達(dá)到32℃時(shí)，THI最低值為72，這一數(shù)值即為奶牛發(fā)生熱應(yīng)激的最低THI。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)南京地區(qū)夏季6月底至8月氣溫條件進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，得出整個(gè)實(shí)驗(yàn)35 d期間牛舍的溫度數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在總共35 d的實(shí)驗(yàn)期中，日間平均氣溫32℃以上持續(xù)時(shí)間達(dá)25 d，最高溫度為38℃。高溫持續(xù)期間THI遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過72，即此實(shí)驗(yàn)條件奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

20世紀(jì)30年代，人們就發(fā)現(xiàn)高溫可以引起產(chǎn)奶量下降。有研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度上升，奶產(chǎn)量會(huì)下降35%～40%[5]；另有研究證實(shí)，高溫與奶牛生產(chǎn)性能之間存在著負(fù)相關(guān)性[6]。Soriani等[10]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)氣溫從21℃上升至38℃時(shí)，產(chǎn)奶量降低程度逐漸加強(qiáng)，38℃時(shí)產(chǎn)奶量?jī)H為21℃的38.9%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱應(yīng)激時(shí)實(shí)驗(yàn)組中奶產(chǎn)量呈直線下降，奶產(chǎn)量的下降與溫度的升高呈明顯的負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致。

多年的研究證實(shí)，隨著溫度的上升，熱應(yīng)激的程度加深，奶牛不僅產(chǎn)奶量減少，而且生鮮乳的品質(zhì)也降低。Regan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，氣溫達(dá)21.1℃時(shí)，生鮮乳的乳脂率有下降趨勢(shì)。Suchanek等[12]對(duì)10個(gè)品種的奶牛研究證實(shí)，在高溫環(huán)境條件下，各品種奶牛產(chǎn)奶的乳脂、乳蛋白、乳糖、乳干物質(zhì)、非脂干物質(zhì)和灰分水平均有所下降。何欽[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氣溫從18℃上升到30℃時(shí)，乳蛋白含量下降16.9%。本研究顯示，乳蛋白含量在實(shí)驗(yàn)的前2周迅速下降，由3.08%下降至2.82%，以后又逐漸回升，但其實(shí)際質(zhì)量在前3周由0.47 kg下降至0.31 kg，后2周保持在較低水平，總體熱應(yīng)激時(shí)可引起乳蛋白降低。

關(guān)于熱應(yīng)激時(shí)乳蛋白降低的機(jī)制的研究尚不多見，侯引緒等[13]認(rèn)為，乳蛋白的降低可能是由于高溫導(dǎo)致了奶牛的蛋白進(jìn)食量降低和皮膚的氮排泄增加造成的，但詳細(xì)的機(jī)制并沒有闡明。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的原料。奶牛血液中氨基酸是乳蛋白合成的前體物和原料，其在血液中的含量決定著乳中蛋白的含量。已有文獻(xiàn)報(bào)道氨基酸適宜均衡的飼料有利于圍產(chǎn)期奶牛乳蛋白的合成[6]。張樹坤等[8]對(duì)泌乳山羊的研究證實(shí)，血液中氨基酸增加，乳蛋白的前體物也增加，乳蛋白含量增加。其在熱應(yīng)激情況下，與乳蛋白的合成的關(guān)系如何，是否如圍產(chǎn)期奶?；蚰躺窖蛞粯佑欣谌榈鞍椎暮铣?？尚沒有研究報(bào)道。為了證實(shí)這一推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組各奶牛血液中游離氨基酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)奶牛處于熱應(yīng)激時(shí)，其血液中游離氨基酸濃度均明顯升高，與以上的研究結(jié)果相反。另外，本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中支鏈氨基酸（主要參與免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝[14-16]），Glu、Asp、Gly和Val等主要的生糖氨基酸（參與糖異生作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)貯存，調(diào)節(jié)基因表達(dá)）[15-21]以及Leu、Ile等生酮氨基酸均顯著升高。提示熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液中高水平的游離氨基酸并未完全用于乳蛋白的合成，也就是說，奶牛機(jī)體處于熱應(yīng)激情況下，血液中氨基酸除了發(fā)揮其作為前體物合成蛋白質(zhì)的作用外，還發(fā)揮了除此之外的其他作用，而后者的作用優(yōu)先于參與乳蛋白的合成。詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

總之，我國夏季多呈高溫高濕天氣，奶牛熱應(yīng)激程度嚴(yán)重，造成產(chǎn)奶量減少，生鮮乳質(zhì)量降低，深入揭示其影響機(jī)制和防控措施是十分重要的。

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Relationship between Free Amino Acids in Cow’s Blood and Decreasing Milk Protein under Heat Stress

AI Yang, CAO Yang, XIE Zhenglu, ZHANG Yuanshu*, SHEN Xiangzhen
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Heat stress is an unspecific reaction of the body in hot and moist environments. Many studies have demonstrated that heat stress can be formed at temperature over 22℃or temperature-humidity index higher than 72. In order to explore the relationship between free amino acids in plasma and milk protein synthesis under heat stress, we selected 6 dairy cows with similar parturition, regular diet and unlimited drink. The experiment lasted 35 days (from June 29 to August 5). The temperature (at 10:00 and 18:00) and milk yield were recorded. The protein content in whole-day milk sample was tested weekly by FOSS milk composition analyzer. Blood samples from jugular vein in both the first and last weeks were also collected. The free amino acid contents in blood samples were analyzed by RP-HPLC system. Our results showed that the milk yield decreased from 15.2 to 10 kg/d as the temperature rose from 26 to 38℃, while milk protein declined from 0.47 to 0.31 kg/d. In blood, Glu, Asp, Gly and Val, known as the main amino acids for gluconeogenesis, increased (0.01 ＜P＜ 0.05), so did Leu and Ile, known as the main amino acids for ketogenesis. The branch chain amino acids (Val, Ile and Leu) responsible for immune response increased significantly. In conclusion, in hot and moist environment, dairy cows were vulnerable to heat stress, which could cause reduction of milk production and milk protein synthesis, suggesting that the high level of blood amino acids could preferentially exert other functions besides milk protein synthesis under heat stress.

heat stress; lactating dairy cows; milk; milk protein; plasma; free amino acids

S827.5

1002-6630（2015）11-0038-04

10.7506/spkx1002-6630-201511008

2014-07-08

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2011CB100802）

艾陽（1987—），男，碩士，主要從事動(dòng)物機(jī)能生物化學(xué)研究。E-mail：Justin-ai@163.com

*通信作者：張?jiān)词纾?962—），女，教授，博士，主要從事乳蛋白生物活性肽和乳品質(zhì)研究。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn