基于蛋白A-瓊脂糖凝膠黃曲霉毒素B1免疫親和柱的制備

龔 燕，楊婷婷，莫曉嵩，張海濤，黃 偉，陸廷瑾，張東升,*，汪海峰

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063；2.江蘇省糧食局糧油質量監(jiān)測所，江蘇 南京 210011；3.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210011）

基于蛋白A-瓊脂糖凝膠黃曲霉毒素B1免疫親和柱的制備

龔 燕1，楊婷婷1，莫曉嵩2，張海濤1，黃 偉2，陸廷瑾1，張東升1,*，汪海峰3

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063；2.江蘇省糧食局糧油質量監(jiān)測所，江蘇 南京 210011；3.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210011）

將初步純化的抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體，定向偶聯(lián)于蛋白A-瓊脂糖凝膠，制備成免疫親和層析柱。結果顯示，辛酸-飽和硫酸銨純化后的單抗質量濃度為17.5 mg/mL，純度為45.1%，抗體亞型為IgG1。取純化后抗體48 ?L與1 mL蛋白A凝膠偶聯(lián)，偶聯(lián)率達98.1%，高效液相色譜測定其平均相對柱容量為105 ng/0.125 mL凝膠、柱空白為0，不同樣品（玉米粉、面粉、花生油、醬油、醋等）平均加標回收率在80%以上。該親和柱在2～8℃保存12 個月后，相對柱容量仍可達72 ng/0.125 mL凝膠。該法制備的親和柱相對柱容量大，穩(wěn)定性好，可用于樣品中黃曲霉毒素B1分離凈化的要求。

黃曲霉毒素B1；蛋白A-瓊脂糖凝膠；定向偶聯(lián)；免疫親和柱

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的一組結構類似的代謝物，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性和致癌性最強，被稱為第一大類致癌物[1]。目前，對于AFB1的檢測方法有薄層層析法[2-3]、酶聯(lián)免疫吸附法[4-9]、免疫親和層析-高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法[10-12]、免疫親和層析-熒光光度法等[13-14]。免疫親和層析柱（immunoaffinity column， IAC）因其高特異性、高靈敏度及凈化效果好等優(yōu)勢，是目前真菌毒素凈化和富集效能最強的樣品前處理技術。為避免非特異性吸附的雜質干擾后續(xù)使用和加快分析速度，增加一次性IAC用量，針對真菌毒素殘留IAC柱的制備成為當前的研究熱點。

目前，國內外多采用溴化氰活化的瓊脂糖為載體[15-17]，以隨機偶聯(lián)的方式將抗體分子無序地固定在層析介質上制備親和柱，而當鍵合位置靠近抗體的結合位點指向有礙與待測物結合的空間時，則抗體的結合能力下降，造成抗體分子被低效利用[18]。為了克服現(xiàn)有技術中存在的問題，本研究采用蛋白A-瓊脂糖凝膠作為固相載體，與辛酸-飽和硫酸銨初步純化的抗AFB1單克隆抗體定向偶聯(lián)，制備一次性、高載量、低成本的IAC，考察較小的柱床體積下完成樣品凈化的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉（散裝）、面粉（風箏牌）、黃豆醬油（好太太）、香醋（鎮(zhèn)江恒順）等樣品均為市購；花生油（CNCA能力驗證樣品，編號CNCA-13-B15-8） 青島出入境檢驗檢疫局；抗AFB1單克隆抗體細胞株SW-1 E10由江蘇省蘇微微生物研究有限公司實驗室篩選并凍存。

蛋白A-瓊脂糖凝膠 美國GE Healthcare公司；二甲基庚二亞胺二鹽酸鹽、AFB1標準品、石蠟、弗氏完全、不完全佐劑 美國Sigma公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；AFB1酶聯(lián)免疫測試盒 江蘇省蘇微微生物研究有限公司；小鼠亞類鑒定試劑盒 美國Proteintech公司；雌性BALB/c小鼠 揚州大學比較醫(yī)學中心；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計 奧地利GBC公司；LC-20AT HPLC儀（含RF-20Axs） 日本島津公司；Nova-Pak?C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4 μm） 美國Waters公司；PHRED-HR后光化學衍生器 北京中科匯仁科技有限公司；HS-3垂直混勻器 寧波新芝生物公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；ZKY-1001真空泵 上海嘉鵬科技有限公司；砂芯漏斗、CO2培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；凈化工作臺 蘇州馮氏實驗動物設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腹水的制備、純化及鑒定

抗AFB1小鼠腹水的制備參考Chu等[19]的操作步驟。取制備的抗AFB1單克隆抗體的小鼠腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨法[20]進行初步純化，0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析得純化抗體，小份量分裝并-70 ℃保存。純化后的抗體采用小鼠亞類鑒定試劑盒進行亞型鑒定。取1 mL純化單抗過蛋白A親和層析柱，甘氨酸-HCl（pH 3.0）洗脫蛋白A親和柱上的結合單抗，收集流出液、洗脫液，紫外分光光度法測定蛋白質量濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[21]測定純化后抗AFB1單克隆抗體的純度。蛋白質量濃度見式（1），抗體純度計算見式（2）。

1.3.2 親和柱的制備

參照Sisson等[22]的方法略有改變。1）膠的洗滌:取1 mL 蛋白A-瓊脂糖凝膠于砂芯漏斗中，用20 mL PBS沖洗2 次，之后用10 mL PBS轉移至50 mL離心管中；2）偶聯(lián):取48 μL純化后的單抗（1.3.1節(jié)）加入到處理好的膠中，室溫垂直混勻1 h，使抗AFB1單克隆抗體與蛋白A充分偶聯(lián)。反應結束后，抽濾，收集反應液，紫外分光光度法測定反應液中未偶聯(lián)的蛋白含量，計算偶聯(lián)率，見公式（3）；3）交聯(lián):抽干膠后，用0.2 mol/L三乙醇胺溶液洗膠1 次，最后用10 mL 0.2 mol/L三乙醇胺溶液轉移膠至離心管中，并緩慢加入20 mg DMP，室溫垂直混勻反應30 min；4）終止反應:抽干膠后，用20 mL 0.2 mol/L三乙醇胺溶液洗滌1 次，然后加入20mL 50 mmol/L乙醇胺溶液，室溫反應5 min；5）洗滌:抽干膠后，加入20 mL甘氨酸-HCl（pH 3.0），室溫反應5 min，反應結束后，20 mL PBS洗滌2 次，并用PBS（含5‰防腐劑)懸浮至4 mL；6）裝柱:取處理好的1 mL柱管及篩板，將下篩板墊好后，取500 μL懸好的膠（相當于0.125 mL膠/支）加入管中，4 ℃沉降過夜后，將上篩板及上下堵頭塞好，2～8 ℃冰箱保存。

1.3.3 AFB1HPLC測定色譜條件

色譜柱:Nova-Pak?C18（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動相:甲醇-水（45∶55，V/V）；流速: 0.7 mL/min；柱后光化學衍生系統(tǒng)；熒光檢測器:發(fā)射波長365 nm、激發(fā)波長440 nm；柱溫30 ℃；進樣體積:20 μL。

1.3.4 抗AFB1單克隆抗體含量與相對柱容量的關系

取1 mL凝膠分別加入30、65、480、900 μL單抗，按照1.3.2節(jié)制備AFB1免疫親和柱。分別測定其相對柱容量（各取3 支親和柱平行測定，取其平均值，即n=3），通過公式（4）、（5）計算柱容量和單抗有效的利用率。

1.3.5 親和柱的評價

1.3.5.1 相對柱容量

取制備好的親和柱，將一定體積的50 ng/mL AFB1標準品溶液（10%甲醇-PBS溶液配制）以1 滴/2 s的速率過親和柱，流出液重復過柱一次，當IAC柱結合能力飽和后，收集流出液，用20 mL水溶液洗滌除雜，最后用1.0 mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用HPLC檢測，按式（6）計算相對柱容量。

1.3.5.2 柱空白

按照1.3.2節(jié)制備步驟，僅在偶聯(lián)過程中用PBS取代單抗，其他步驟都一樣，制備空白柱。按照1.3.5.1節(jié)柱容量的測定過程來檢測AFB1在該空白柱中的保留情況。

1.3.6 上樣緩沖液流速的選擇

AFB1的上樣量為45 ng，分別以2、1 滴/s、1 滴/2 s的流速通過柱體，收集流出液及甲醇洗脫液，HPLC法測定其中AFB1的含量，進而確定最佳上樣流速。

1.3.7 洗脫液體積及甲醇體積分數的選擇

AFB1上樣量為45 ng，分別用1～3 mL 50%、80%甲醇溶液和100%甲醇進行洗脫，收集洗脫液，用HPLC法測定其中AFB1含量，確定最佳洗脫條件。

1.3.8 不同質量濃度的回收率

分別取1 mL質量濃度為0、1、5、10、20、50 ng/mL AFB1標準溶液過6 支免疫親和柱，用1 mL純甲醇洗脫，收集洗脫液用HPLC法測定AFB1含量，計算回收率。

1.3.9 不同樣品加標回收率的測定

1.3.9.1 玉米粉不同加標水平回收率

分別將25、100、250 ng AFB1標準品加入到5 g粉碎的玉米樣品（經HPLC及酶聯(lián)免疫吸附測定AFB1含量為0水平）中，加入1 g NaCl，再加入25 mL 70%甲醇-水，振蕩30 min，過濾收集濾液。取10 mL濾液加入20 mL水混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，取15 mL濾液過柱。收集1 mL純甲醇洗脫液，待測。

1.3.9.2 面粉、花生油加標回收

分別將110 ng AFB1標準品加入到5.0 g的面粉樣品及花生油中，樣品提取及過柱純化方法同1.3.9.1節(jié)，同時做空白對照。

1.3.9.3 醬油加標回收

將100 ng的AFB1標準品加入到5.0 g陰性樣品中，加入0.25 g NaCl，再加入80%甲醇-水至10 mL，振蕩30 min，過濾收集濾液。取5 mL濾液加入20 mL水混勻，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至7.0左右，玻璃纖維濾紙過濾，取10 mL過柱。收集1 mL色譜純甲醇洗脫液，待測。

1.3.9.4 醋加標回收

將100 ng AFB1標準品加入到5.0 g樣品中，加入1.0 g NaCl，用pH 7.0的PBS稀釋至25 mL，振蕩30 min，過濾收集濾液。取10 mL濾液加入10 mL pH 7.0的PBS混勻，玻璃纖維濾紙過濾，取10 mL過柱。收集1 mL色譜純甲醇洗脫液，待測。同時做空白對照。樣品的加標回收率按公式（7）計算:

1.3.10 重復使用次數和穩(wěn)定性

同一支使用后的親和柱經2 mL 70%甲醇溶液沖洗再生，最后用10 mL PBS緩沖溶液沖洗柱子，放4 ℃保存，隔天測定相對柱容量。將60 支制備好的親和柱，于2～8 ℃保存，每隔1 個月取3 支測定相對柱容量，繪制變化曲線。

2 結果與分析

2.1 抗AFB1單克隆抗體純化前后蛋白質量濃度和SDSPAGE測定結果

表1 純化單抗的質量濃度及純度測定結果Table1 The concentration and purity of Mc-Ab

辛酸-飽和硫酸銨純化后，結果見表1。蛋白質量濃度為17.5 mg/mL，蛋白A柱純化流出液蛋白質量濃度8.5 mg/mL，酸洗脫得到的蛋白質量濃度為2.4 mg/mL。通過計算得抗體純度為45.1%，通過小鼠亞類鑒定試劑盒測定的單抗亞型為IgG1。

圖1 抗AFB1單克隆抗體純化前后SDS-PPAAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE of anti-AFB1Mc-Ab before and after purification

由圖1可以看出，辛酸-硫酸銨純化后的抗體仍含較多的雜蛋白，通過蛋白A親和柱純化后抗體較純，有重鏈（約57 kD）和輕鏈（約25 kD）2 條清晰的條帶。通過2、3泳道的條帶發(fā)現(xiàn)結果一致，辛酸-飽和硫酸銨純化后的抗體再經過蛋白A親和柱純化，流出液為雜蛋白，而偶聯(lián)后有效單抗基本結合，雜蛋白保留在反應液中，通過計算偶聯(lián)率為98.1%。

2.2 抗AFB1單克隆抗體含量與相對柱容量的關系

取純化抗體體積為30、65、480、900 μL時，制備的AFB1親和柱平均相對柱容量分別為61.7（變異系數(coefficient of variation,CV)為5.3%）、135.0（CV為6.6%）、994.2（CV為4.7%）、1 816（CV為3.3%）ng/0.125 mL，相對柱容量隨抗體含量的增加而增大。以每支固載的抗體含量（mg）為橫坐標，以相對柱容量（ng/0.125 mL）為縱坐標，得線性回歸方程:y=2 047.9x+ 6.719 3，R2=0.999 8。結果表明，7.10 mg單抗（900 μL純化單抗所含有的抗AFB1單抗的量）與1 mL蛋白A-凝膠偶聯(lián)，遠沒有超過蛋白A-凝膠（1 mL至少結合30 mg人IgG）的結合上限。

IgG的摩爾質量為1.5×105g/moL，理想狀態(tài)下每個抗體分子可以與2 個抗原分子結合，那么固載了48.0 ?g抗AFB1單抗的理想柱容量為199.7 ng/0.125 mL變異系數(coefficient of variation,CV)膠。實驗測得的柱容量為105 ng/0.125 mL，即抗體有效利用率為52.6%。因為空間位阻、熱力學參數、反應平衡系數K等原因，即使在溶液中免疫反應也無法達到每個抗體分子與2 個分子抗原結合的理想狀態(tài)[16]。由于105 ng/0.125 mL的IAC柱已滿足市場需求，制備該親和柱來評價和應用。

2.3 親和柱的評價

HPLC測定結果表明，1.3.2節(jié)中制備的親和柱平均相對柱容量為105 ng/0.125 mL，需要辛酸-飽和硫酸銨純化單抗48.0 ?g。

當免疫親和柱被過量上樣時，樣品中的AFB1除可與抗體特異性結合外，還可與瓊脂糖凝膠基質或非抗體蛋白發(fā)生非特異性吸附[23]。因此，甲醇洗脫液中的AFB1是特異性作用和非特異性作用的加和值。而相對柱容量應該只是由抗體引起的吸附量，因此需從實驗得到的加和值中扣除非特異性吸附作用部分。由于無法在親和柱上直接測量AFB1的非特異性吸附量，因此制備了蛋白A空白凝膠柱，5 支空白柱平行測定柱空白為0，說明偶聯(lián)載體對AFB1無非特異性吸附，以較小的柱體積完成凈化是可行的。

2.4 上樣緩沖液流速的選擇

對上樣流出液和甲醇洗脫液進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)上樣流速不小于2滴/s時，樣品中的AFB1有一部分流出，說明該流速過快，使得親和柱內的抗體和抗原（AFB1）結合不充分。在1滴/s、1滴/2 s時流出液中的均沒有檢出AFB1，建議上樣流速最快不能超過1滴/s。

2.5 洗脫液體積及甲醇體積分數的選擇

由圖2可看出，80%甲醇溶液和100%甲醇的洗脫效果相近，某種程度下可替換100%洗脫；而50%甲醇溶液洗脫明顯不夠，還有50%以上的AFB1尚未洗脫下來。對于80%甲醇溶液和100%甲醇的洗脫，1 mL甲醇洗脫率即可達到95%以上，第2～3毫升基本沒有AFB1洗脫下來，考慮到增加洗脫液體積會引起樣品的稀釋，降低檢測靈敏度，因此，選擇1 mL純甲醇洗脫液較為合適。

圖2 不同體積分數甲醇的洗脫效果(n=3)Fig.2 Elution of AFB1by different concentrations of methanol (n=3)

2.6 線性關系

表2 不同質量濃度AFB1過親和柱含量測定及回收率Table2 Recovery rates of AFB at different initial concentrations after affinity column chromatography

6 組不同質量濃度的AFB1過免疫親和柱后，通過HPLC法測定的含量及回收率結果如表2所示。說明該親和柱在高、中、低AFB1含量時，吸附和洗脫AFB1效果理想。低質量濃度（1、5 ng/mL）標準柱回收率均達到了95%以上，提示對于低含量樣品凈化時，親和柱對AFB1無截留。

2.7 不同樣品的加標回收率

表3 不同樣品的加標回收結果(n=3)Table3 Recoveries of AFB spiked in different samples (n=3)

對玉米、面粉、花生油、醬油、醋等樣品的加標回收結果見表3。3次重復平均回收率均在80%以上，CV為3.8%～8.1%。說明親和柱適應性廣，凈化效率高。

2.8 重復使用次數和穩(wěn)定性

使用后的親和柱通過再生，當第5次使用后，親和柱的相對柱容量從105 ng/0.125 mL凝膠下降至65 ng/0.125 mL凝膠。有實驗[24-25]表明導致IAC柱容量下降的主要因素是洗脫步驟，其次是固定抗體的逸失，貯存時間和樣品基質對柱容量影響不明顯，因此，純甲醇洗脫后，迅速用70%甲醇溶液除雜質后，立即用5～10 倍柱體積PBS緩沖溶液平衡親和柱，有利于保護親和柱中抗體的活性。圖3顯示，親和柱在2～8 ℃保存前6 個月，相對柱容量緩慢下降20%左右，之后6～12 個月相對柱容量基本保持穩(wěn)定，12 個月后相對柱容量又開始緩慢下降。保存12 個月后，相對柱容量仍可達72 ng/0.125 mL凝膠，此時，通過減少上樣體積等方法，該親和柱仍可滿足實驗要求。

圖3 親和柱(2～8 ℃貯存)相對柱容量隨時間變化曲線(n=3)Fig.3 Relative column capacity of the affinity column as a function of storage time at 2-8 ℃ (n=3)

3 結 論

以蛋白A-瓊脂糖凝膠為配基定向偶聯(lián)單抗，成功制備了AFB1免疫親和柱。單抗偶聯(lián)率達98.1%，取48 ?L純化抗體偶聯(lián)，平均相對柱容量在105 ng/0.125 mL凝膠。柱空白測試表明蛋白A空白凝膠對AFB1無非特異性吸附。不同樣品不同質量濃度添加回收實驗表明，較小的柱體積能滿足樣品中AFB1的凈化。

偶聯(lián)時單抗純度要求不高。從偶聯(lián)后的反應液電泳結果可知，條帶為雜蛋白，且有效單抗全部偶聯(lián)在蛋白A上，揭示該法偶聯(lián)單抗對其純度沒有過高的要求，由于蛋白A對IgG1有特異性結合，辛酸-飽和硫酸銨初步純化抗體即可滿足偶聯(lián)要求。

定向偶聯(lián)過程中單抗有效利用率為52.7%。章英等[17]將純化好的單抗與溴化氰活化的4FF葡聚糖偶聯(lián)制備抗ZEN單克隆抗體免疫親和柱，固載350 ?g ZEN單克隆抗體的容量為0.40 ?g，則抗體的有效利用率為26.93%。從不同偶聯(lián)方法制備真菌毒素親和柱的單抗有效利用率來比較，蛋白A-凝膠的定向偶聯(lián)是溴化氰活化隨機偶聯(lián)的1.96 倍。該結果與黃昕等[26]報道MG31-r protein A-Sepharose FF的抗原結合容量是MG31-CNBr-Sepharose 4B抗原結合容量的1.8 倍結論相同，說明定向偶聯(lián)有助于提高免疫親和吸附劑的抗原結合容量。定向偶聯(lián)過程中交聯(lián)條件的優(yōu)化及2 種偶聯(lián)方法制備AFB1免疫親和柱的比較是下一步研究的方向。

為避免重復使用帶來雜質的干擾和加快分析速度，一次性IAC柱成為期待，但單抗的低效利用及凝膠載體的浪費是成本居高不下的主要因素。傳統(tǒng)CNBr活化的瓊脂糖凝膠制備IAC柱時，凝膠成本占50%，單抗占30%。雖然蛋白A-瓊脂糖凝膠較CNBr活化的瓊脂糖凝膠貴近50%，但是通過定向偶聯(lián)單抗有效利用率提高了1 倍，且在柱容量不變的情況下IAC柱體積縮減一半，使得制備總成本節(jié)約了近30%。隨著重組蛋白A、單抗等規(guī)模化生產，低成本、大容量、一次性IAC柱的使用將變?yōu)楝F(xiàn)實。

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Preparation of Immunoaffinity Column for AFB1with Monoclonal Antibodies Immobilized on Protein A-Sepharose

GONG Yan1, YANG Tingting1, MO Xiaosong2, ZHANG Haitao1, HUANG Wei2, LU Tingjin1, ZHANG Dongsheng1,*, WANG Haifeng3
(1. Jiangsu Suwei Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, China; 2. Grain and Oil Quality Monitoring Bureau of Grain in Jiangsu Province, Nanjing 210011, China; 3. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210011, China)

The immunoaffinity column (IAC) for aflatoxin B1(AFB1) was prepared by directed coupling of protein A-sepharose with the anti-AFB1monoclonal antibody which was preliminarily purifi ed by caprylic acid-ammonium sulfate method. The results showed that the concentration, purity and antibody subtype of the purifi ed monoclonal antibody were 17.5 mg/mL, 45.1% and IgG1,respectively. When coupling 48 ?L of purifi ed antibody with protein A-sepharose, and the coupling rate was 98.1%. The average relative column capacity and column blank were 105 ng/0.125 mL gel and 0, respectively. The average recoveries of standard addition in different samples (corn fl our, wheat fl our, peanut oil, soy sauce) were all above 80%. After being stored at 2–8 ℃ for 12 months, the relative capacity of the IAC was 72 ng/0.125 mL gel. These results show that the anti-AFB1affi nity column prepared by this method has large relative capacity and good stability which meet the requirement for separation and purifi cation of AFB1from real samples.

afl atoxin B1; protein A-sepharose; directed coupling; immunoaffi nity column

O657

A

10.7506/spkx1002-6630-201510043

2014-09-26

無錫市農業(yè)科技支撐項目(CLE02N1405)

龔燕(1974—),女,副研究員,學士,研究方向為食品安全。E-mail：526137895@qq.com

*通信作者：張東升(1975—),男,副研究員,學士,研究方向為食品安全。E-mail：zds0127@sina.com