豬博卡病毒的研究概況

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（烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063）

豬博卡病毒的研究概況

蔡擴軍，陳發(fā)喜，李愛巧，楊啟元，韓 涌，李建玲，范玉娟

（烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063）

博卡病毒是近幾年被發(fā)現(xiàn)的一種人、豬、牛、犬、猩猩等多種哺乳動物共患的新型DNA病毒，本文概述了博卡病毒的生物學(xué)特性，從流行病學(xué)的角度介紹了豬博卡病在國內(nèi)外流行情況及對豬博卡病毒的檢測方法，為豬博卡病毒的深入研究、防控及做好公共衛(wèi)生安全提供參考。

豬；博卡病毒；研究概況；公共衛(wèi)生；流行病學(xué)

豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）是2009年一種新發(fā)現(xiàn)的DNA病毒，該病原體的臨床致病機制至今未得到證實，但多篇報道表明PBoV可能與仔豬腹瀉病癥的發(fā)生存在一定關(guān)系[1]。自2011年以來，我國大部分地區(qū)豬場的哺乳仔豬發(fā)生腹瀉，而且反復(fù)發(fā)作，抗菌藥防治和疫苗免疫效果均比較差，發(fā)病率和死亡率較高，疑似為新的病毒病感染[2-3]。有研究認為是豬流行性腹瀉病毒變異毒株所致，同時有些科研單位用分子生物學(xué)方法對采集的發(fā)病豬的小腸或腹瀉物進行檢測，發(fā)現(xiàn)PBoV在不同地區(qū)具有不同的陽性率，但未能確定引起本次豬腹瀉疫情的主要病原以及PBoV在其中承擔(dān)的角色。烏魯木齊市通過豬的流行病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)病種以腹瀉病癥為主，其中哺乳仔豬的腹瀉最為嚴重，其發(fā)病率和死亡率平均分別為9.49%和3.37%。因此，深入研究PBoV對于該病的防控不僅在新疆而且在全國具有重要意義，本文從多個方面對PBoV進行了概述。

1 病毒的發(fā)現(xiàn)及命名

2005年，瑞典科研工作者在患有下呼吸道疾病的瑞典兒童體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)人博卡病毒[4]。2009年，瑞典科學(xué)家又利用宿主DNA清除、隨機多重置換擴增方法（random multiple displacement amplifi cation，MDA）在患仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的豬淋巴結(jié)中檢測到博卡病毒，通過測序發(fā)現(xiàn)其基因序列與人類博卡病毒相近，故將其歸類到細小病毒亞科、博卡病毒屬，命名為豬博卡樣病毒[5]。隨后，通過對其接近全長的基因組進行擴增和測序，進一步證明了該病毒屬于博卡病毒屬，與犬博卡病毒的親緣關(guān)系較近，因此正式命名為豬博卡病毒（PBoV）[6]。2010年，Kapoor等從患有急性腸炎的大猩猩體內(nèi)分離鑒定出了一種新的博卡病毒[7]。隨后各國科研工作者陸續(xù)從斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征、高熱病、具有腹瀉癥狀和臨床健康豬群中檢測到PBoV。

2 分子生物學(xué)特性

博卡病毒是細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬的新成員。博卡病毒屬包括牛細小病毒、人類博卡病毒、犬微小病毒、大猩猩博卡病毒和豬博卡病毒。通過對PBoV全長基因組的測序與序列分析，發(fā)現(xiàn)我國所流行的PBoV與瑞典的毒株具有非常高同源性，基因序列與犬小病毒的親緣關(guān)系更近，而與豬細小病毒的基因組同源性僅為52%～53%。

博卡病毒是單股線狀無囊膜DNA病毒，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其體積很小，呈正二十面體結(jié)構(gòu)，直 徑 大 小 為25nm～30nm[8]。 根 據(jù)NCBI Gen-Bank報 道，PBoV基 因 組 全 長4756bp（Gen-Bank：KF206157.1）-5292bp（GenBank：KC473563.1），能自動利用內(nèi)部回文序列對DNA基因組進行復(fù)制[7]。已確定有3個開放性閱讀框，ORF1在5′末端，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，該結(jié)構(gòu)在病毒基因組的復(fù)制過程中起到非常重要作用[9]。ORF3在基因組的中間，編碼磷酸化的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，是博卡病毒的特征結(jié)構(gòu)。ORF2編碼重疊的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，研究表明該結(jié)構(gòu)蛋白具有典型依賴鈣離子的分泌性憐脂酶A2活性，對于病毒DNA從吞噬體進入細胞核這一過程起到關(guān)鍵性作用[10-11]（圖1）。在不用報道中博卡病毒利用不同的基因區(qū)域（NS1，VP1，NP1）做系統(tǒng)分析的基因分型不相同，造成新的博卡病毒難以和以前發(fā)現(xiàn)的相區(qū)別[12]。依據(jù)病毒分類國際委員會（ICTV）標(biāo)準(zhǔn)，只要非結(jié)構(gòu)基因的遺傳同源性小于95%的種類即可被確定為博卡病毒屬中的一個新種類，按照此標(biāo)準(zhǔn)，PBoV可分為超過5種類型（PBoV1～PBoV5）。建立在VP1和VP2部分基因上的PBoV（PBoV1）首次在瑞典感染PMWS豬中發(fā)現(xiàn)；接著在2010年，1型和2型PBoV全基因組被報道[13]；以選擇的VP1基因片段進行系統(tǒng)分析的3型和4型兩種新型PBoV在香港被報道[14]；5型PBoV的整個基因組在一頭具有腹瀉臨床癥狀仔豬的糞便中被發(fā)現(xiàn)和報道[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，博卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1較為保守，而VP1和VP2兩個衣殼蛋白較易發(fā)生突變，這提示不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的基因突變可能是導(dǎo)致新種群產(chǎn)生的重要原因，也可能是該病毒逃逸機體免疫監(jiān)視的重要機制，提示穩(wěn)定的NS1基因則可能成為制備疫苗和藥物作用的靶位點[16]。

圖1 PBoV的基因結(jié)構(gòu)模式圖

3 流行病學(xué)

3.1 國外流行情況

PBoV在美國、瑞典、羅馬尼亞、匈牙利、北愛爾蘭等國家均有感染發(fā)生。2009年，Blomstrom A L等使用PCR方法對瑞典58頭豬的樣品進行了豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、PBoV和輸血傳播肝炎病毒（TTV）檢測，其中34頭小豬患 PMWS，24頭未患 PMWS，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)患PMWS病豬中TTV-1、TTV-2、PBoV和PCV2的感染率分別為77%、94%、88%和100%，而未患PMWS的豬群陽性率分別為79%、83%、46%和80%，這表明，患PMWS豬群往往引起多種病毒的混合感染，但是PBoV在PMWS發(fā)病過程承擔(dān)的角色還需要進一步研究[5]。羅馬尼亞Cadar D等分別對2006年和2010年采集的842頭野豬樣品進行PBoV的檢測，發(fā)現(xiàn)PBoV陽性率從9.14%提高到了17.74%，其中6-12月齡野豬的陽性率為77.06%，12～36月齡野豬的陽性率為22.94%，分析結(jié)果表明低年齡段豬群對PBoV更易感[24]。2011年，McKillen J等對北愛爾蘭采集的369份豬血清用間接免疫熒光法進行檢測，發(fā)現(xiàn)PBoV3和PBoV4陽性率分別為8.7%和9.5%，他們還利用細胞培養(yǎng)技術(shù)在患PMWS病豬的糞便中分離到PBoV3和PBoV4，對其基因組序列進行測序，長度分別為5082bp和4125bp[8]。Zhai S 的通過研究發(fā)現(xiàn)具有呼吸道癥狀的豬群中豬博卡樣病毒的陽性率為38.7%，而健康豬群的陽性率僅為7.3%，二者差異顯著，因此他們認為豬博卡樣病毒可能是導(dǎo)致豬呼吸道疾病的一個新病毒[6]。

3.2 國內(nèi)流行情況

2009年，翟少倫等對我國部分省市豬場的191份臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示75份為PBoV 陽性，且組織樣品中的檢出率顯著高于血清及精液樣品中的檢出率，這表明PBoV在我國豬群中相當(dāng)流行，而且該病毒在不同組織器官中分布不同。2010年，翟少倫等核對北京市、河北省、安徽省和新疆維吾爾自治區(qū)PBoV陽性率大于70%以上樣品信息，發(fā)現(xiàn)這些豬場的發(fā)病率和死亡率較高，并且病豬具有明顯的呼吸癥狀，剖檢時發(fā)現(xiàn)肺組織有病變[17-19]。

鄧波等對上海市各區(qū)（縣）規(guī)模豬場2006—2011年不同月份采集的1800份豬血清、45份豬糞便、27份豬鼻棉拭以及門診采集的9份高熱病死豬內(nèi)臟進行檢測，陽性率依次為24%、30%、0%、67%。對6份PBoV 陽性病料進行豬細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒 2 型（PCV2）的檢測，結(jié)果陽性率依次為 0%、83%、0%和100%。檢測結(jié)果表明，PBoV 感染在上海市普遍存在，從豬內(nèi)臟器官組織中檢出率較高，且春季和秋季發(fā)病率較高，仔豬相對比較易感，并與PRRSV、PCV2 存在混合感染的情況[20]。

2011年9月，中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心從河南某屠宰場采集了臨床健康豬只的組織樣品進行豬群疫病流行病學(xué)調(diào)查，從部分樣品中檢測到了PBoV。同年，Li B等通過實時熒光PCR方法對258份豬樣品進行檢測，檢測結(jié)果顯示PBoV陽性率為44.2%，其中PMWS發(fā)病豬群的PBoV陽性率為56.1%，顯著高于健康豬群的16.7%的陽性率[21]。Li B等還從具有腹瀉癥狀病豬的糞便樣品中鑒定出一株P(guān)BoVJS677株，經(jīng)全基因組測序、比對發(fā)現(xiàn)，JS677株的全基因組與其他PBoV毒株的同源性為48.7%～86.3%，NS1和NP1基因的同源性分別為48.7%～86.2%和31.9%～82.1%，依據(jù)ICTV的分類標(biāo)準(zhǔn)，屬于新型的PBoV，被命名為PBoV5[15]。

2011年，中國香港學(xué)者Lau SK等從香港生豬屠宰場和養(yǎng)豬場的健康豬和病死豬中采集333份健康豬和病死豬的淋巴結(jié)、血清和糞便等樣品，通過PCR方法檢出55份PBoV陽性樣品，陽性率為16.5%。同時對PBoV全基因組進行測序和序列分析，發(fā)現(xiàn)了不同型PBoV毒株間存在重組事件[14]。胡軍勇等對河南、湖北、湖南的各大豬場進行了流行病學(xué)調(diào)查，在79個規(guī)模化豬場采集的248份病料樣品中有172份樣品為PBoV陽性，平均陽性率達到了69.35%，其中PBoV在4個規(guī)?；i場的腹瀉豬群中的陽性率達到 73.95 %，并顯著高于非腹瀉豬群（47.83 %）。本研究調(diào)查結(jié)果顯示PBoV 在國內(nèi)豬群中廣泛流行，且感染率較高[22]。

2014年，Liu Mengmeng等人對在2006-2012年收集的來自中國5個省的403份腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、肺、腎、肝、脾等組織樣品進行PCR檢測，其中108份來自屠宰場，70份來自具有臨床腹瀉、咳嗽或者低燒癥狀的發(fā)病豬，150份來自60日齡的后備豬。檢測結(jié)果顯示PBoV陽性率為11.41%。其中腹股溝淋巴結(jié)和脾臟的檢出率為27.18%和20.75%，顯著高于下頜淋巴結(jié)（6.25%）和和扁桃體（1.30%），肺臟、腎臟、肝臟全為陰性。表明PBoV在山東的流行率（41.68%）高于河南（11%）和遼寧（10%）[23]。

4 檢測方法

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

2010年，翟少倫等人參照當(dāng)時GenBank發(fā)表的PBoV的唯一序列，在PBoV的 VP1和VP2基因區(qū)域設(shè)計了一對特異性的引物，初步建立了PBoV的PCR檢測方法。該方法特異性強，敏感度高，重復(fù)性好，在國內(nèi)首次建立了 PCR擴增檢測PBoV的方法[19]。胡軍勇等根據(jù)PBoV的NS1基因序列設(shè)計一對引物，該方法能夠從 PBoV陽性樣品中特異性的擴增出482 bp的片段，特異性試驗顯示該方法對PRV、PPV和PCV2等核酸樣品檢測均為陰性，敏感性試驗顯示，該PCR方法對 PBoV 的最低檢測量為213.6拷貝[21]。

為建立快速檢測PBoV所有基因型的診斷方法，蔡雨函等根據(jù)GenBank中公布的PBoV的不同基因型序列，對其進行同源性分析，分別設(shè)計出擴增PBoV1/PBoV2 /PBoV3/ PBoV4/PBoV5的引物，在分別建立單一PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，通過對兩組引物的比例、退火溫度等條件的優(yōu)化，首次建立了同時檢測（PBoV1～PBoV5）雙重PCR方法。檢測結(jié)果顯示建立的雙重PCR能成功檢測出PBoV所有基因型，并能區(qū)分（PBoV1～PBoV5），通過特異性試驗、敏感性試驗及重復(fù)性試驗驗證了該方法的可靠性，為PBoV診斷和預(yù)防提供了技術(shù)支持[25]。

4.2 實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）

Li等建立了PBoV1的RT-PCR診斷方法，在對258份臨床樣品進行檢測時，陽性率達44.2%，敏感性試驗達到了20個質(zhì)?？截?，特異性與重復(fù)性均較好[20]。上海市動物疫病預(yù)防控制中心鄧波等根據(jù)GenBank公布的PBoV（PBoV）序列，通過VP1和VP2基因設(shè)計引物和Taq Man探針建立實時熒光定量PCR檢測方法。建立的方法與PCV、PRRS、PPV及均無交叉反應(yīng)，具有較高特異性，在107copies/mL～101copies/mL模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.997，最低可檢測到101copies/mL的陽性質(zhì)粒。說明所建立的PBoV實時熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性好、精確性高和耗時短等優(yōu)點[26]。

4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)

李彬等建立了一種PBoV的LAMP檢測方法，并根據(jù)方法和原理組裝了一套檢測試劑盒，該試劑盒含有4條引物，首先提取待檢樣品的核酸，然后利用LAMP檢測試劑盒對提取的核酸進行檢測，從而判斷樣品中是否含有PBoV。該試劑盒不需要先進的儀器設(shè)備，并且具有特異性強、敏感度高、耗時短、操作簡便以及易于推廣等優(yōu)點[27]。

4.4 間接免疫熒光法

McKillen J等建立了PBoV的原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，同時為了鑒定病毒在細胞上的生長情況，還建立了間接免疫熒光方法，結(jié)果在豬原代腎細胞的細胞核發(fā)現(xiàn)綠色熒光，而細胞核周圍細胞質(zhì)的顏色較暗[8]。

另外，李彬等將PBoV的 NP1、VP2基因進行了原核表達。結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白有很高的表達量，且以可溶性蛋白形式存在；經(jīng)過柱純化后，該蛋白純度較高；Western Blot鑒定后證明該蛋白具有很好的反應(yīng)原性。目前研究結(jié)果都表明NP1和VP2蛋白可作為診斷抗原的候選蛋白，為PBoV的血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)[28-29]。

5 展望

目前，博卡病毒或博卡樣病毒已經(jīng)在奶牛、犬、人類、大猩猩和豬等多種動物宿主中被檢測出來。據(jù)報道，博卡病毒在世界不同人類民族中的流行率為1.5%～24.6%，而且越來越多的證據(jù)顯示博卡病毒是人類下呼吸道感染的病原體[30]。博卡病毒在國內(nèi)外豬群中同樣存在普遍感染，并且缺乏有效的防控措施。該病毒的臨床致病機制目前尚不清楚，是否存在與其它病原體協(xié)同致病仍需進一步研究。鑒于整個生物循環(huán)系統(tǒng)中人類和豬的親密關(guān)系，我們不能完全排除PBoV與人博卡病毒發(fā)生基因重組甚至感染人的可能性，因此，對PBoV深入研究還具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

[1] Huang L，Zhai S L，Cheung A K，et al. Detection of a novel porcine parvovirus，PPV4，in Chinese swine herds[J]. Virol J. 2010，7：333.

[2] 王幼明，倪雪霞，蓋華武，等. 一起豬群腹瀉暴發(fā)的回顧性研究[J]. 中國動物檢疫，2011，28（2）：59-61.

[3] 朱書梁，何少華，游秋花，等. 當(dāng)前規(guī)?；i場病毒性腹瀉的防控策略[J]. 中國動物檢疫，2013，30（6）：58-61.

[4] Allander T，Tammi M T，Eriksson M，et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratorytract samples[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2005，102（36）：12891-12896.

[5] Blomstr?m A L ，Belák S，F(xiàn)ossum C，et al. Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J]. Virus Res，2009，146（1/2）：125-129.

[6] Zhai S L，Yue C，Wei Z Z，et al. High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China[J]. Arch Virol，2010，155（8）：1313-1317.

[7] Kapoor A，Mehta N，Esper F，et al. Identification and characterization of a new bocavirus species in gorillas[J]. PLoS One，2010，5（7）：e11948.

[8] McKillen J，McNeilly F，Duffy C，et al. Isolation in cell cultures and initial characterisation of two novel bocavirus species from swine in Northern Ireland[J]. Vet Microbiol. 2011，152（1/2）：39-45.

[9] Sun Y，Chen A Y，Cheng F. Molecular characterization of infectious clones of the minute virus of canines reveals unique features of bocaviruses[J]．J Virol，2009，83（8）：3956-3967．

[10] Manteufel J，Truyen U. Animal bocaviruses：a brief review[J]. Intervirology，2008，51（5）：328-334.

[11] Luo Y，Chen A Y，Qiu J. Bocavirus infection induces a DNA damage response that facilitates viral DNA replication and mediates cell death[J]．Journal of Virology，2011，85（1）：133-145．

[12] Cheng W X，Li J S，Huang C P，et al. Identification and nearly full-length genome characterization of novel porcine bocaviruses[J]. PLoS One，2010，5（10）：e13583.

[13] Fu X，Wang X，Ni B，et al. Recombination analysis based on the complete genome of bocavirus[J]. Virol J，2011，8：182.

[14] Lau S K，Woo P C，Yip C C，et al. Co-existence of multiple strains of two novel porcine bocaviruses in the same pig，a previously undescribed phenomenon in members of the family Parvoviridae，and evidence for inter-and intra-host genetic diversity and recombination[J]. J Gen Virol. 2011，（Pt 9）：2047-2059.

[15] Li B，Ma J，Xiao S，et al. Complete genome sequence of a novel species of Porcine Bocavirus，PBoV5[J]. J Virol，2012，86（2）：1286-1287.

[16] 羅迪賢，劉巧突，林應(yīng)標(biāo)，等. 人類博卡病毒基因組序列與進化分析[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，13（6）：1430-1432.

[17] Tong G Z，Zhou Y J，Hao X F，et al. Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，China [J]. Emerg Infect Dis，2007，13（9）：1434-1436.

[18] Tian K，Yu X，Zhao T，et al. Emergence of fatal PRRSV variants：unpara lle led outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J]. PLoS One，2007，2（6）：e526.

[19] 翟少倫，岳城，韋祖樟，等. 豬博卡病毒 PCR 檢測方法的建立及其應(yīng)用[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（2）：14-17.

[20] 鄧波，劉佩紅，周錦萍，等. 上海市豬博卡病毒感染情況調(diào)查[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2012，20（3）：62-66. [21] Li B，Xiao S，Ma J，et al. Development of a novel TaqMan-based real-time PCR assay for the detection of porcine boca-like virus（Pbo-likeV）[J]. Virol J，2011，8：357.

[22] 胡軍勇，張倩，王丹丹，等. 豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（8）：632-636.

[23] Liu M，Li Y，Sun D，et al. Detection and Genetic Analysis of Porcine Bocavirus in Different Swine Herds in North Central China[J]. Scientifi c World Journal，2014，2014.

[24] Cadar D，Cságola A，Lorincz M，et al. Genetic detection and analysis of porcine bocavirus type 1 （PoBoV1）in European wild boar（Sus scrofa）[J]. Virus Genes，2011，43（3）：376-379.

[25] 蔡雨函，朱玲，周遠成，等. 豬博卡病毒雙重PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2113，43（8）：833-838.

[26] 鄧波，劉佩紅，周錦萍，等. 豬博卡病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2012，33（9）：70-74.

[27] 李彬，何孔旺，溫立斌，等. 豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法：中國，201110092345[P]. 2011-04-13.

[28] 李彬，毛立，何孔旺. 豬博卡病毒 NP1 基因的克隆與原核表達[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2011，26（3）：28-31.

[29] 李彬，杜露平，何孔旺，等. 豬博卡病毒 VP2 基因的克隆與原核表達[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（4）：796-799．

[30] Deng Y，Gu X，Zhao X，et al. High viral load of human bocavirus correlates with duration of wheezing in children with severe lower respiratory tract infection[J]. PLoS One，2012，7（3）：e34353.

A Summary of Researches on Porcine Bocavirus

Cai Kuojun，Chen Faxi，Li Aiqiao，Yang Qiyuan，Han Yong，Li Jianling，F(xiàn)an Yujuan
（Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Centre，Urumqi，Xinjiang 830063）

Bocavirus is a newly discovered DNA virus infecting human，swine，bovine，canine，gorilla and other mammal species in recent years. In this paper，studies on porcine Bocavirus were summarized with regard to its biological characteristics，epidemiology and distribution both at home and abroad，so as to provide reference for further study on porcine Bocavirus and its effective prevention and control.

porcine Bocavirus（PBoV）；research；public health；epidemiology

S858.28

：A

：1005-944X（2015）02-0042-05

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技援疆項目（201491165）；重慶市集成示范計劃項目（cstc2014jcsf00001）

李愛巧