猴源人隱孢子蟲的分離與鑒定

徐前明，程家林，李國清*，葉亦見，梁詳解，岳彩玲，高振勇

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州510663)

隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲感染而引起的以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的一種人獸共患原蟲病。隱孢子蟲可感染大多數(shù)脊椎動物，包括人類，免疫正常的個體感染后引起自限性腹瀉，在免疫功能受損的患者則引起漸進(jìn)性致死性腹瀉。目前，公認(rèn)的隱孢子蟲有18種[1]。關(guān)于靈長類包括猴在內(nèi)感染隱孢子蟲已見報道，但蟲體的分類地位尚未明確[2]。Xiao等從猴體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一株人隱孢子蟲(Cryptosporidium hominis)，并對該蟲的部分基因進(jìn)行了研究[3]。在關(guān)于隱孢子蟲種和基因型與宿主關(guān)系的闡述中，Xiao和Ryan進(jìn)一步明確了C.hominis可以感染靈長類動物，說明C.hominis可以感染猴，至于猴的品種與C.hominis存在何種相關(guān)性有待于進(jìn)一步確定[1]。本研究以恒河猴(Macaca mulatta)為研究對象，對其感染的隱孢子蟲進(jìn)行了分離和鑒定，旨在探明感染不同靈長類動物的隱孢子蟲種類以及與感染人的C.hominis之間的遺傳差異，以便更好地控制C.hominis由靈長類動物傳播給人或相互傳播途徑，為防治該病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與蟲株 恒河猴來自廣東省靈長類實(shí)驗(yàn)動物中心的實(shí)驗(yàn)用猴。隱孢子蟲蟲株是從恒河猴糞便中采用蔗糖漂浮法分離而得。

1.2 主要試劑 EXTaq酶、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、pMD18-T載體質(zhì)粒系統(tǒng)均為TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白酶K購自Merk公司；蛋白胨和酵母浸出物購自O(shè)XOID公司；氨芐青霉素、Tris堿和十二烷基硫酸鈉(SDS)購自廣州美津生物技術(shù)有限公司；蔗糖購自天津大茂化學(xué)試劑廠；堿性品紅購自北京瀛海精細(xì)化工廠；孔雀綠購自天津化學(xué)試劑一廠。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定 卵囊的分離與純化以及改良抗酸法染色均參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。熒光顯微鏡觀察參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。

1.4 蟲體基因組DNA的抽提 將純化后的隱孢子蟲卵囊在液氮中反復(fù)凍融3次，加入270 μL的蟲體裂解緩沖液輕輕混勻，再加入30 μL 20 mg/mL的蛋白酶K進(jìn)行消化，55℃水浴24 h，其間混勻多次，使卵囊裂解充分。加入等體積的氯仿，混勻，12000 r/min離心10 min，將其上清轉(zhuǎn)移至一新的eppendorf管中，加入0.7倍體積的異丙醇沉淀20 min，12000 r/min離心10 min，去上清，用70%乙醇洗滌，12000 r/min離心5 min，去上清，沉淀物于干燥箱內(nèi)干燥10 min，用50 μL TE溶液(pH8.0)進(jìn)行溶解，加入 1 μL RNase A(10 mg/mL)消化 RNA，電泳檢測。提取的基因組DNA于-20℃冰箱凍存、備用。

1.5 引物設(shè)計 擴(kuò)增卵囊壁蛋白(COWP)基因的引物參照GenBank登錄的序列(QQ388399.1)進(jìn)行設(shè)計。引物為Pc1：5'-GGACTGAAATACAGGCATTATCTT G-3'； Pc2： 5'-GTAGATAATGGAAGAGATTGTG-3'，預(yù)計擴(kuò)增片段大小為554 bp。擴(kuò)增18S rRNA基因的引物參照GenBank登錄的序列(EU032325.1)進(jìn)行設(shè)計。引物為18SF：5'-AGTGACAAGAAATAACAA TACAGG-3'；18SR：5'-CCTGCTTTAAGCACTCTAA TTTTC-3'，預(yù)計擴(kuò)增片段大小為370 bp左右。

1.6 卵囊壁蛋白(COWP)和18S rRNA基因的擴(kuò)增25 μL 反應(yīng)體系為：ddH2O 15.85 μL； 10×buffer 2.5 μL；25 mmol/L MgCl21.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；上、下游引物(20 pmol/μL)各 1 μL；基因組DNA 1 μL； EXTaq 酶 (1 u/μL)0.15 μL。 擴(kuò) 增COWP基因的反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增18S rRNA基因的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃5 min；16℃保存。

1.7 序列測定與分析 分別將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD-18-T載體中，陽性克隆送交上海生物工程有限公司進(jìn)行測序；對所得的序列采用Mega4.0軟件進(jìn)行序列分析，采用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色和熒光檢查結(jié)果 卵囊經(jīng)抗酸染色后呈玫瑰紅色，形狀規(guī)則，似圓形或橢圓形；卵囊內(nèi)含有4個呈月牙形的子孢子，均被染成玫瑰紅色，且有明顯的折光(圖1)。而其他非特異性顆粒則不易著色。低倍熒光顯微鏡下對卵囊自發(fā)熒光進(jìn)行觀察，可見卵囊為一圓形小亮點(diǎn)，呈現(xiàn)乳白色熒光；卵囊壁周圍略深染，中央淡染，似環(huán)狀(圖2)。

2.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果 猴源隱孢子蟲COWP基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果，可見在550 bp左右有明顯的目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)；猴源隱孢子蟲18S rRNA基因PCR擴(kuò)增，可見在370 bp左右有明顯的目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。

2.3 基因序列分析 將所獲得的猴源隱孢子蟲兩個基因的序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，其與Gen-Bank登錄的C.hominisCOWP基因序列(QQ388399.1)和18S rRNA基因序列(FJ707311.1)的相似性均為100%。所得COWP基因序列經(jīng)鄰接法分析后，結(jié)果表明猴源隱孢子蟲與C.hominis相關(guān)基因序列遺傳距離最近(圖5)。所得18S rRNA基因序列經(jīng)鄰接法分析后，結(jié)果表明猴源隱孢子蟲與C.hominis相關(guān)基因序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的遺傳距離最近(圖6)。

3 討 論

隱孢子蟲屬于頂復(fù)門的寄生原蟲，主要寄生在胃腸道上皮細(xì)胞微絨毛的刷狀緣，可廣泛感染包括人類在內(nèi)的脊椎動物，而且各種隱孢子蟲的致病性不同。微小隱孢子蟲(C.parvum)是隱孢子蟲中致病性最強(qiáng)的一種，可感染人和多種動物。此外，C.hominis主要感染人，也可感染靈長類動物[1]，已證實(shí)松鼠猴、獼猴和東南非猴的腹瀉與隱孢子蟲感染有關(guān)[2，6-7]。Xiao等對各種宿主的隱孢子蟲相關(guān)基因作了進(jìn)化樹分析，認(rèn)為猴源隱孢子蟲和人源隱孢子蟲在分類上最為接近，并從猴體內(nèi)分離到一種變異性較大的C.hominis[3，8]?；陟`長類動物與人類的親緣關(guān)系，對猴源隱孢子蟲準(zhǔn)確鑒定不僅有助于蟲種分類地位的確定，也有助于分子流行病學(xué)調(diào)查，以便防止隱孢子蟲由猴傳播給人。這不僅對獸醫(yī)工作具有積極意義，在公共衛(wèi)生學(xué)上也具有重要作用。

人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲的形態(tài)基本相似。近年來，有關(guān)靈長類隱孢子蟲包括從松鼠猴、綠猴、紅狐猴、狨、蜘蛛猴、赤猴、狒狒[9-11]和大猩猩[12]糞便中分離的隱孢子蟲在形態(tài)上均難以與C.parvum進(jìn)行區(qū)別。本研究所分離的猴源隱孢子蟲大小為4.6 μm～5.2 μm×3.7 μm～4.0 μm，雖然與 Ryan 等報道的人隱孢子蟲大小基本一致，但從形態(tài)方面亦很難與C.parvum進(jìn)行區(qū)別，需要借助分子生物學(xué)方法進(jìn)行分子鑒定[13]。

常用于隱孢子蟲分子分類的遺傳標(biāo)記有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因，如18S rRNA基因、COWP基因、血小板反應(yīng)素相關(guān)粘附蛋白(TRAP)基因、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、70 ku熱休克蛋白(HSP70)基因和乙酰輔酶A合成酶基因以及易變異的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-1和ITS-2)[14]。其中，COWP和18S rRNA以及HSP70基因在隱孢子蟲鑒定方面最為常用[15]。本研究對猴源隱孢子蟲鑒定時選用了COWP和18S rRNA作為參考基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所用的參考基因均能有效地鑒定猴源隱孢子蟲種類。猴源隱孢子蟲的COWP和18S rRNA基因測序結(jié)果經(jīng)NCBI信息庫比對，所得到的兩個基因序列與C.hominis同一基因的相似性均為100%。對分離的猴源隱孢子蟲的COWP和18S rRNA基因序列采用鄰接法作進(jìn)化樹分析，它們在進(jìn)化樹上的遺傳距離均與C.hominis最為接近，這與Xiao[3]的報道基本一致。綜合上述分析，我們認(rèn)為本次分離的猴源隱孢子蟲屬于C.hominis。

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