流行性乙型腦炎病毒E蛋白的截短表達與間接ELISA診斷方法的建立

祖立闖，王金良，管 宇，沈志強，*，董 林，李 嬌

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

流行性乙型腦炎病毒E蛋白的截短表達與間接ELISA診斷方法的建立

祖立闖1，王金良2，管 宇2，沈志強1，2*，董 林2，李 嬌1

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

為建立一種快速檢測流行性乙型腦炎病毒抗體的方法，本研究參照已發(fā)表的JEV基因組序列，應(yīng)用RT-PCR擴增了長約1 000 bp的E基因片段，連接pET30a表達載體中，經(jīng)誘導(dǎo)后獲得了以包涵體形式表達的重組E蛋白。重組蛋白純化后，經(jīng)免疫印跡檢測證明其具有良好的抗原性和特異性。以該蛋白作為診斷抗原，建立了檢測流行性乙型腦炎病毒抗體的E-ELISA診斷方法。該診斷方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，為JEV的快速診斷、免疫豬群抗體監(jiān)測和JEV流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、簡便的血清學(xué)診斷方法。

乙型腦炎病毒；E蛋白；截短表達；間接ELISA

流行性乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV）引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變的急性傳染病，也是一種人畜共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識障礙、驚厥、強直性痙攣和腦膜刺激等神經(jīng)癥狀為主要特征[1]。該病以蚊蟲為媒介傳播，對人類危害巨大，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一[1]。我國是乙腦發(fā)病人數(shù)最多的國家，占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上，病死率10%以上，幸存者中約有15.3%留有不同程度的后遺癥[2]。在動物中，豬是本病的中間宿主，帶毒豬是本病的主要傳染源，它與蚊形成了蚊、豬循環(huán)傳播模式，并對病毒起放大器作用，可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎；公豬發(fā)生睪丸炎；仔豬因腦炎死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1，3]。

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，基因組長11 kb(10 976 bp），整個基因組只有一個開放閱讀框架，編碼一個全長3 432個氨基酸的多蛋白前體[4]。該多蛋白前體經(jīng)蛋白酶切割加工，產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(C）、膜蛋白(PrM/M）、囊膜糖蛋白(E）；7個非結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。E基因大小為1 500 bp，編碼500個氨基酸，E蛋白具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)侵襲性的致病位點，作為膜融合蛋白促使病毒進入神經(jīng)細(xì)胞[6]。E蛋白還是JEV病毒粒子表面最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其表面的抗原決定簇具有血凝活性和中和活性，能刺激機體產(chǎn)生血凝抑制抗體、補體結(jié)合抗體、中和抗體，引起宿主產(chǎn)生保護性的免疫應(yīng)答，從而保護機體免受病毒攻擊[7-9]。本研究對E基因進行了截短表達，并建立了間接ELISA診斷方法，為流行性乙型腦炎診斷試劑盒的研制提供了有力的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞與血清 JEV毒株DH5α、 BL21(DE3）、 pET30a(+）、 倉 鼠 腎 細(xì) 胞BHK-21均由本實驗室保存。由本實驗分離并保存。豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2）、豬偽狂犬病病毒(PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV）、豬細(xì)小病毒(PPV）、豬流行性腹瀉病毒(PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV）、豬瘟病毒(CSFV）陽性血清及JEV參考陰陽性血清均購自深圳康百得生物科技有限公司，其它血清樣品由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor、ExTaq酶、pMD18-T、T4 DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連）有限公司；兔抗豬IgG辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記抗體、低分子量蛋白Marker均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；TRIzol、質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄的JEV基因組序列(AF315119.1），利用oligo6.2設(shè)計擴增E基因的一對引物，P1 5'-GCGAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC-3'；P25'-GCGAAGCTTCGCAACGGAAACAATCG-3'，引物由上海生物工程公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取 將JEV接種于BHK-21單層細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的病變后，收獲病毒，按TRIzol試劑說明提取病毒基因組RNA。

1.5 E基因的RT-PCR擴增與克隆 以提取的病毒基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃5 min、94℃l min，56℃l min，72℃ l min，共進行30個循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體于4℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR及EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-E，由上海生物工程公司進行序列測定。

1.6 E基因表達載體的構(gòu)建與鑒定 利用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切pMD18-E，回收目的片段，將其定向克隆到經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切的pET30a表達載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，經(jīng)PCR及酶切鑒定后獲得重組表達載體pET-E。鑒定陽性克隆送上海生物工程有限公司測序，以驗證其閱讀框架。

1.7 pET-E重組蛋白的表達與純化 將pET-E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞，采用不同誘導(dǎo)劑濃度、不同時間、不同溫度誘導(dǎo)pET-E重組蛋白的表達。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度。以最佳條件誘導(dǎo)表達后，超聲破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清及沉淀進行SDS-PAGE分析，鑒定目的蛋白是以包涵體形式存在于沉淀中，用尿素對其進行變性處理，包涵體溶解后采用鎳離子親和層析法純化，純化蛋白透析復(fù)性，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.8 E重組蛋白的western blot活性檢測 純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加JEV陽性血清(1∶100稀釋）37℃作用1 h，TBST緩沖液洗3次，加入兔抗豬IgG辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記抗體(1∶5 000稀釋）37℃作用50 min，TBST緩沖液洗3次，在二氨基聯(lián)苯胺(DAB）緩沖溶液中顯色10 min。

1.9 間接ELISA診斷方法的建立

1.9.1 JEV E-ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗在相同的反應(yīng)條件下，分別將重組抗原以不同包被濃度與待檢樣品的不同稀釋倍數(shù)、不同封閉液與不同封閉時間、二抗不同稀釋倍數(shù)與不同作用時間組成方陣，經(jīng)方陣滴定試驗分別進行各組份的條件優(yōu)化。原則是陽性血清OD450nm≈1.0，陰性血清OD450nm＜0.2，選取P/N值最大的各個組合。在相同反應(yīng)條件下，與待檢樣品分別作用30 min～120 min，底物分別顯色5 min～20 min，選擇陽性血清OD450nm≈1.0，陰性血清OD450nm＜0.2，P/N值最大的一抗、底物作用時間。

1.9.2 JEV E-ELISA判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定試驗判定標(biāo)準(zhǔn)采用Cut-Off值法，血凝抑制試驗(HI）檢測為陰性的38份血清樣本，利用JEV E-ELISA已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件檢測，將OD450nm值轉(zhuǎn)換成S/P值，計算出38份血清的S/P平均值(χ）和標(biāo)準(zhǔn)差(SD），我們規(guī)定 S/P(樣本）≥χ+3SD時為陽性，S/P(樣本）＜χ+2SD時為陰性，當(dāng)χ+2SD≤S/P(樣本）＜χ+3SD為可疑，需重新檢測樣本，重檢時S/P值≥χ+2SD時判為陽性，S/P值＜χ+2SD時為陰性。

1.9.3 特異性試驗以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)與PCV-2、PRV、PRRSV、PPV、PEDV、TGEV、CSFV陽性血清進行間接JEV E-ELISA檢測，同時設(shè)JEV標(biāo)準(zhǔn)陽、陰性血清對照，確定重組抗原與其它常見豬病陽性血清是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.9.4 敏感性試驗將JEV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清按1∶50～1∶25 600倍稀釋，每個稀釋度平行做4個重復(fù)，用建立的JEV E-ELISA檢測，測定OD450nm值，將其換算成S/P值，確定其抗體檢出效價。

1.9.5 重復(fù)性試驗(1）批內(nèi)重復(fù)性試驗，選取8份JEV抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，每份血清樣本平行做8個重復(fù)，用JEV E-ELISA檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。(2）批間重復(fù)性試驗，選取8份JEV抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，在4個不同時間用JEV E-ELISA檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析；在相同試驗條件下，用4批不同時間純化的重組抗原進行JEV E-ELISA檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9.6 符合性試驗血凝抑制試驗(HI）檢測結(jié)果為陽性和陰性的血清樣本共156份，再用JEV E-ELISA檢測，以HI檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計算E-ELISA相對于HI的符合率、敏感性、特異性。

1.10 現(xiàn)地應(yīng)用試驗 應(yīng)用本實驗建立的JEV EELISA檢測了來自山東、河南、河北等地的658份血清樣本，確定JEV血清抗體陽性率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增、克隆及重組表達質(zhì)粒的鑒定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在位于約1 000 bp處可見特異性DNA擴增條帶，與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的pMD-E質(zhì)粒經(jīng)PCR及EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定后，測序結(jié)果表明克隆序列與參考毒株完全相同。構(gòu)建的pET-E重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定后，測序結(jié)果表明其閱讀框正確。

2.2 E重組蛋白的表達及純化 以最佳條件(誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)劑濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時間為5 h）誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE表明所表達蛋白的分子量為45 ku，薄層掃描分析表明目的蛋白占菌體總蛋白的33.8%。目的蛋白大部分是以包涵體形式表達的，包涵體經(jīng)8 M尿素變性后，采用鎳離子親和層析法純化，純化后的蛋白透析復(fù)性。薄層掃描分析表明復(fù)性后蛋白的純度高達89.5%，Bradford法測定蛋白濃度為0.216 mg/mL(圖1）。

2.3 E重組蛋白的活性鑒定 純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，與JEV陽性血清作用(圖2）。表明該重組蛋白能與JEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而空載體表達菌與JEV陽性血清沒有反應(yīng)。

2.4 JEV E-ELISA相關(guān)條件確定試驗結(jié)果

2.4.1 JEV E-ELISA最佳反應(yīng)條件的確定重組抗原最佳包被濃度為5.4 μg/mL；最佳封閉液為含1%BSA的PBST，最佳封閉時間為37℃作用1.5 h；血清樣本最佳稀釋倍數(shù)為1∶100，最佳作用時間為37℃作用1 h；二抗最佳工作濃度為1∶5 000，最佳作用時間為37℃作用1 h；底物最佳顯色時間為15 min。

2.4.2 JEV E-ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定38份陰性血清，經(jīng)JEV E-ELISA檢測后，將血清樣本分成5組，以S/P值為橫坐標(biāo)，以各組樣品數(shù)量為縱坐標(biāo)，得到JEV陰性的血清S/P數(shù)值分布直方圖(圖3），這些樣本的S/P值主要分布在0.05～0.20之間，占血清樣本的89.5%，數(shù)據(jù)分布合理，可以作為制定判定標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。計算得出38份陰性血清S/P，當(dāng)S/P(樣本）≥0.294時判為陽性；S/P(樣本）＜0.239時判為陰性；0.239≤S/P(樣本）＜0.294時判為可疑。對可疑樣本須重新檢測，重檢時，S/P(樣本）≥0.239為陽性，S/P(樣本）＜0.239為陰性。

2.5 特異性試驗結(jié)果 重組抗原與常見的PCV-2、PRV、PRRSV、PPV、PEDV、TGEV、CSFV 7種豬病陽性血清反應(yīng)的S/P值均低于0.239，呈陰性反應(yīng)。該結(jié)果表明重組蛋白與常見7種豬病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出了很好的特異性。

2.6 敏感性試驗結(jié)果 檢測JEV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清，當(dāng)血清稀釋至12 800倍時，檢測結(jié)果仍為陽性(圖4），證明所建立的方法具有較好的敏感性。

2.7 重復(fù)性試驗結(jié)果 批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)小于5%(表1），不同時間、不同批次重組抗原的批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)均小于10%(表2、表3）。說明JEV E-ELISA具有良好的重復(fù)性。

表1 間接ELISA批內(nèi)重復(fù)結(jié)果Table 1 Intro-batch repeatability test of the indirect ELISA

表2 不同時間批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Different time of inter-batch repetition test

表3 不同批次重組抗原批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Different batches recombinant antigens of inter-batch repetition test

2.8 比較試驗結(jié)果 HI檢測結(jié)果為陽性的121份血清樣本，JEV E-ELISA檢出陽性102份，陰性19份；HI檢測結(jié)果為陰性的45份血清樣本，JEV E-ELISA檢出陰性36份，陽性9份。JEV E-ELISA相對于HI的符合率為83.1%，敏感性為84.3%，特異性為80.0%(表4）。

2.9 現(xiàn)地應(yīng)用試驗結(jié)果 應(yīng)用本實驗建立的JEVE-ELISA檢測了來自山東、河南等地的658份血清樣本，檢出陽性448份，血清抗體陽性率為68.1%。

表4 JEV E-ELISA與HI符合率試驗結(jié)果Table 4 Agreement test between JEV E-ELISA and HI

3 討論

目前，黃病毒的疫苗大多數(shù)是針對E蛋白的抗原表位。Chen等研究認(rèn)為，E蛋白是唯一能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗JEV中和抗體的重要抗原[10]。Kolaskar等的研究表明，E蛋白含有3個抗原域：域Ⅰ，也稱為中心域，由E1位～E51位、E137位～E196位和E293位～E311位的130個氨基酸殘基組成，此域有糖基化位點和具有血清學(xué)及生物學(xué)活性的抗原表位；域Ⅱ，由E52位～E136位和E197位～E292位的181個氨基酸殘基組成，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域Ⅲ，由E312位～E411位的100個氨基酸殘基組成，參與受體結(jié)合過程，在黃病毒屬中十分保守[11]。Chia等把截短的JEV E蛋白基因(不含跨膜區(qū)）分為“A”、“B”兩段在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)下游片段(B）表達產(chǎn)物的抗原性和免疫原性優(yōu)于上游片段(A）[12]。本研究通過DNAStar生物學(xué)軟件分析目的蛋白的生物學(xué)特性，截取抗原性較好的E1位～E343位的氨基酸殘基，其包含了完整的域Ⅰ、域Ⅱ及“A”、“B”片段，所以表達的蛋白具有良好的抗原性。

本實驗選擇pET30a原核表達載體，表達了JEV的E蛋白，經(jīng)免疫印跡試驗證實所截短表達的E蛋白可與JEV陽性血清發(fā)生較強的反應(yīng)，表明重組E蛋白具有良好的反應(yīng)性與特異性。

目前在JEV的流行病學(xué)調(diào)查中，常用HI試驗、補體結(jié)合試驗、中和試驗等檢測方法，但常規(guī)的血凝抑制試驗、補體結(jié)合試驗、中和試驗等血清學(xué)診斷方法費時費力，特異性和敏感性不高，ELISA診斷方法具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測快速、重復(fù)性好、高通量、成本低等特點，是當(dāng)前動物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測廣泛采用的血清學(xué)診斷技術(shù)[13]。由于JEV的全病毒抗原制備過程繁瑣、存在潛在的危險性及缺少標(biāo)準(zhǔn)化，因此，利用基因工程表達的重組抗原已逐步得到重視。同時，這種重組抗原只能與該病毒特定成份所誘生的抗體發(fā)生反應(yīng)，因而可用于亞單位或標(biāo)記疫苗免疫動物與自然感染動物的鑒別診斷。本實驗所表達的重組E蛋白具有良好的反應(yīng)活性，作為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法具有很好的敏感性和特異性，為我國JEV的診斷、疫苗免疫水平監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡便、快速的血清學(xué)檢測方法。

[1]Konishi E,Pincus S,Paoletti E,et al.Avipox virus-vectored Japanese encephalitis virus vaccines:use as vaccine candidates in combination with purified sub unit immunogens[J].Vaccine,1994,12(7）:633-638.

[2]陳煥春.規(guī)?；B(yǎng)豬場疫病控制與凈化[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，187.

[3]Wang J W，F(xiàn)u S H，Wang H Y，et al.Isolation and identification of Japanese encephalitis virus in Liaoning province[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20(1）:61-65.

[4]McMinn P C.The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses[J].J Gen Virol,1997,78(11）:2711-2722.

[5]Chen W R,Tesh R B,Rico-Hesse R.Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature[J].J Gen Virol,1990,71(12）:2915-2922.

[6]Mandl C W,Guirakhoo F,Holzmann H,et al.Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level,using tick-borne encephalitis virus as a model[J].J Virol,1989,63(2）:564-571.

[7]Takegami T,Miyamoto H,Nakamura H,et al.Biological activities of the structural proteins of Japanese encephalitis virus[J].Acta Virol,1982,26(5）:312-320.

[8]Li P,Zheng Q S,Wang Q,et al.Immune responses of recombinant adenoviruses expressing immunodominant epitopes against Japanese encephalitis virus[J].Vaccine,2008,26(46）:5802-5807.

[9]Li Y,Ye J,Cao S,et al.Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice[J].J Gene Med,2009,11(2）:150-159.

[10]Chen H W,Pan C H,Liau M Y,et al.Screening of protective antigens of Japanese encephalitis virus by DNA immunization:a comparative study with conventional viral vaccines[J].J Virol,1999,73(12）:10127-10145.

[11]Kolaskar A S,Kulkarni Kale U.Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J].Virology,1999,261(1）:31-42.

[12]Chia S C,Leung P S,Liao C P,et al.Fragment of Japanese encephalitis virus envelope protein produced inE.coliprotects mice from virus challenge[J].Microb Pathog,2001,31(1）:9-19.

[13]Konishi E,Mason P W,Shope R E.Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant antigens for serodiagnosis of Japanese encephalitis[J].J Med Virol,1996,48(1）:76-79.

Development of an indirect ELISA for detecting antibodies to japanese encephalitis virus using recombinant truncated glycoprotein E expressed inE.coli

ZU Li-chuang1,WANG Jin-liang2,GUAN Yu2,SHEN Zhi-qiang1,2*,DONG Lin2,LI Jiao1

(1.Shandong Lvdu Bio-Sciences and Technology Co.Ltd.,Binzhou 256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China）

In this study,DNA fragment encoding the Japanese encephalitis virus(JEV）E protein was amplified by RT-PCR,cloned and expressed inE.coli.An indirect ELISA was successfully developed to detect anti-JEV antibody using the purified recombinant E protein as coating antigen.The assay was specific,sensitive and reproducible,which could be used as a rapid serology detection method for monitoring of anti-JEV antibody and epidemiologic survey of JEV.

japanese encephalitis virus;E protein;prokaryotic expression;indirect ELISA;diagnosis

S852.659.6

A

1008-0589(2010）03-0200-05

*Correspondingauthor

2009-07-21

祖立闖(1981-），男，黑龍江賓縣人，碩士，從事動物病毒學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：bzshenzq@vip.sina.com

(本文編輯：彭永剛）