口蹄疫病毒R株致弱前后的基因變異研究

賀東生，林小敏，蘇丹萍,羅滿林，林紹榮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州， 510642）

口蹄疫病毒R株致弱前后的基因變異研究

賀東生，林小敏，蘇丹萍,羅滿林，林紹榮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州， 510642）

為研究口蹄疫病毒(FMDV）致弱前后基因組變化的關(guān)系，本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的口蹄疫病毒全基因序列數(shù)，設(shè)計(jì)了8對(duì)引物，采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增出FMDV R株及其致弱毒株(R304）編碼區(qū)的8段基因，將各片段克隆至pMD18-T載體，并進(jìn)行序列測(cè)定。比較和分析編碼區(qū)各個(gè)基因(LP、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）的核苷酸序列和氨基酸序列的變異。結(jié)果表明，R株和R304株基因組區(qū)全長(zhǎng)均為6 966 nt，編碼2 322個(gè)氨基酸，致弱后共有110個(gè)核苷酸發(fā)生變化，編碼氨基酸有32個(gè)發(fā)生變化；其中3A基因的氨基酸序列變化最大，其次為L(zhǎng)P和VP1，而2A和2C的氨基酸未發(fā)生變異。該研究對(duì)口蹄疫病毒的抗原和毒力研究有重要的參考價(jià)值。

口蹄疫病毒；減毒；基因；變異

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是偶蹄動(dòng)物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，傳播迅速、感染率高，往往形成大范圍流行，被國(guó)際獸疫局(OIE）列為A類動(dòng)物疫病之首。該病原為FMD病毒(FMDV），屬于微RNA病毒科(Picornaviridae）口蹄疫病毒屬(aphthovirus），有7個(gè)血清型，型間無(wú)交叉反應(yīng)。完整病毒含有RNA、衣殼蛋白和少量的非結(jié)構(gòu)蛋白和宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白?；蚪M為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約8.5 kb，由5'非翻譯區(qū)(UTR）、3'UTR和一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF）組成。5'UTR長(zhǎng)約1 300堿基，含有VPg(3B）蛋白、S片段、特殊的100堿基～200堿基的poly(C）區(qū)段、功能未知區(qū)(FUR）和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES）。3'UTR由一段長(zhǎng)約90堿基的核苷酸序列和poly(A）尾巴組成。ORF長(zhǎng)約6.5 kb，由L(引導(dǎo)蛋白）、P1結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，以L、P1、P2和P3的順序依次排列，編碼一聚合蛋白，該聚合蛋白隨后逐級(jí)被降解為病毒所需的各個(gè)組分L/L'、P1(1A、1B、1C和1D，即VP4、VP2、VP3、VP1）、P2(2A、2B 和 2C）和 P3(3A、3B、3C 和 3D）[1]。

本研究根據(jù)口蹄疫病毒的全基因序列，設(shè)計(jì)了多對(duì)特異性引物，用RT-PCR方法獲得各基因片段，并進(jìn)行克隆、序列測(cè)定，首次揭示了口蹄疫病毒連續(xù)傳代致弱后的基因變異情況，為該病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 病毒株 FMDV R株，為豬的O型口蹄疫強(qiáng)毒，R株經(jīng)鈷60照射并在雛雞傳304代的弱毒為R304株，由本院家畜傳染病教研室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌DH5α菌株由本教研室保存；總RNA抽提試劑TRIzol為北京塞白盛生物工程有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV為日本TOYOBO公司產(chǎn)品；PCR所用試劑、限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖芯鶠镺mega公司產(chǎn)品。

1.3 引 物 參考GenBank中的FMDV全基因序列(AY317098，AY593813，AY593817，AF026168，AJ539136）設(shè)計(jì)覆蓋了整個(gè)基因組編碼區(qū)的8對(duì)特異性引物(表1），兩個(gè)相鄰片段之間有部分重疊(圖1）。

1.4 病毒總RNA的提取 病毒總RNA的提取，在生物安全三級(jí)(BSL3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)參照TRIzol試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增各基因片段 以病毒RNA為模板，采用下游引物，按照反轉(zhuǎn)錄操作說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行cDNA合成。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體積為100 μL，其反應(yīng)條件為：95℃4 min，95℃40 s、55℃1 min、72℃1 min、30個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用Omega膠回收試劑盒回收。

1.6 各基因片段的克隆和序列測(cè)定 回收片段經(jīng)加A尾反應(yīng)后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，用氨芐抗性篩選出帶有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的單菌落后，菌液經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性，用Omega質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ、BamHⅠ雙酶切鑒定。鑒定為陽(yáng)性的菌液送到上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，將各基因序列進(jìn)行拼接。

表1 擴(kuò)增基因組編碼區(qū)的各對(duì)引物序列Table 1 Primer sequences for FMDV gene amplification

1.7 基因組測(cè)序 用軟件DNAStar5.0推導(dǎo)相應(yīng)編碼的氨基酸序列，并比較強(qiáng)弱毒株各基因的核苷酸序列和氨基酸序列的差異。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)過(guò)重復(fù)性擴(kuò)增和序列分析后，確定FMDV強(qiáng)、弱毒株的編碼區(qū)從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA前的長(zhǎng)度均為6 966 nt，編碼2 322氨基酸。強(qiáng)弱病毒各基因及其推導(dǎo)氨基酸的長(zhǎng)度如表2所示。致弱前后各基因的核苷酸及其編碼氨基酸變異情況如下：LP基因長(zhǎng)603 nt，編碼201個(gè)氨基酸，致弱后14個(gè)堿基發(fā)生突變，推導(dǎo)的氨基酸5個(gè)發(fā)生突變(Q26H、H95R、I115T、M126V、E165G）；VP4基因長(zhǎng)255 nt，編碼85個(gè)氨基酸，致弱后4個(gè)堿基發(fā)生突變，推導(dǎo)的氨基酸2個(gè)發(fā)生突變(G10E、K70R）；VP2基因長(zhǎng)654 nt，編碼218個(gè)氨基酸，致弱后11個(gè)堿基發(fā)生突變，2個(gè)氨基酸發(fā)生突變(N134K、L142P）；VP3基因長(zhǎng) 660 nt，編碼 220個(gè)氨基酸，致弱后13個(gè)堿基發(fā)生突變，2個(gè)氨基酸發(fā)生突變(S70P、S158P）；VP1基因長(zhǎng) 633 nt，編碼211個(gè)氨基酸，致弱后8個(gè)堿基發(fā)生突變，5個(gè)氨基酸 發(fā) 生 突 變 (P65L、 T68A、 D138G、 T152A、E156K）；2A基因長(zhǎng)54 nt，編碼18個(gè)氨基酸，致弱后2個(gè)堿基發(fā)生突變，氨基酸未變化；2B基因長(zhǎng)462 nt，編碼154個(gè)氨基酸，致弱后9個(gè)堿基發(fā)生突變，11個(gè)氨基酸發(fā)生突變(T17I、I18V、I128T）；2C基因長(zhǎng)954 nt，編碼318個(gè)氨基酸，致弱后12個(gè)堿基發(fā)生突變，氨基酸沒(méi)有變化；3A基因長(zhǎng)429 nt，編碼143個(gè)氨基酸，致弱后12個(gè)堿基發(fā)生突變，7個(gè)氨基酸發(fā)生突變(E37K、T51A、E78G、P119L、E138G、R141Q、A142T）；3B基因長(zhǎng) 213 nt，編碼71個(gè)氨基酸，致弱后3個(gè)堿基發(fā)生突變，1個(gè)氨基酸發(fā)生突變(N66D）；3D基因長(zhǎng)1 410 nt，編碼470個(gè)氨基酸，致弱后15個(gè)堿基發(fā)生突變，2個(gè)氨基酸發(fā)生突變(V13I、P113S）。

表2 FMDV強(qiáng)弱毒株基因及其推導(dǎo)氨基酸序列的變異Table 2 Mutation of nucleotide acid and deduced amino acid sequence of FMDV R and R304 strain

FMDV結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。研究已表明，VP1編碼1D蛋白，它暴露于病毒的表面，是決定病毒抗原性的主要部分，1B、1C、1D位于衣殼表面，為外衣殼蛋白。分離后僅1D能使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒的中和抗體，但4種結(jié)構(gòu)多肽都參與免疫原性的產(chǎn)生，不同血清型病毒的抗原位點(diǎn)有所不同[2]。O型病毒有5個(gè)位點(diǎn)，其中3個(gè)位于VP1基因上，抗原位點(diǎn)1由1D G-H環(huán)(133 aa～157 aa和200 aa～213 aa）的線性表位組成，該位點(diǎn)是FMDV最重要的抗原位點(diǎn)，也是FMDV抗原變異的關(guān)鍵區(qū)域，G-H環(huán)還具有誘導(dǎo)中和抗體并與中和抗體相互作用的雙重功能。已經(jīng)證明，某些氨基酸的突變會(huì)影響病毒的抗原性，稱為關(guān)鍵氨基酸，抗原位點(diǎn)1的關(guān)鍵氨基酸為 V144、L148、K154、P208，抗原位點(diǎn) 3位于VP1的βB-C環(huán)上，其關(guān)鍵氨基酸為T(mén)43和P44；抗原位點(diǎn)5位于VP1 G-H環(huán)內(nèi)，其關(guān)鍵氨基酸為Q149[3]。另外，在145 aa～148 aa為高度保守的RGDL基序。RGD是一種細(xì)胞表面受體分子識(shí)別基序。FMDV可以通過(guò)對(duì)精氨酸－苷氨酸－天冬氨酸(RGD）基序識(shí)別細(xì)胞表面的整聯(lián)體分子而吸附在細(xì)胞表面[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R株致弱后VP1蛋白中雖然有5個(gè)氨基酸發(fā)生了改變，但在關(guān)鍵的免疫原性位點(diǎn)(145 aa～148 aa）沒(méi)有發(fā)生變化，仍為保守的RGDL結(jié)構(gòu)，提示致弱后的FMDV R304株保留有較好的抗原性，這與早期進(jìn)行的該毒株生物學(xué)特性的研究結(jié)果相符。

另外，F(xiàn)MDV非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。FMDV L蛋白有兩種形式Lab和Lb，這是由于核糖體可在相距84個(gè)堿基的兩個(gè)AUG起始不同閱讀框架進(jìn)行翻譯的結(jié)果，其中兩個(gè)AUG相比，第二個(gè)AUG具有真核核糖體識(shí)別有效起始翻譯的特征性序列AXX AUG G[5]。L蛋白具有蛋白酶活性，參與關(guān)閉宿主細(xì)胞的蛋白合成，是病毒致病和傳染的必需基因，氨基酸C51、H148和D164是L蛋白酶的活性中心。有研究還表明，L蛋白發(fā)揮作用的形式有兩種，分別為分子內(nèi)切割和分子間切割。而殘基VQK(K或R）LKGAGQS在所有FMDV血清型中均保守，但哪個(gè)殘基為切割所必需仍不清楚[6]。本研究測(cè)序結(jié)果表明R株致弱前后兩個(gè)起始密碼子的位置并沒(méi)有改變，而3個(gè)活性中心氨基酸也沒(méi)有發(fā)生變化。在強(qiáng)弱毒株的L蛋白最后5個(gè)氨基酸和VP4蛋白的前5個(gè)氨基酸均可以找到保守的VQKRLK和GAGQS基序。

非結(jié)構(gòu)蛋白P2中的2AB/C與病毒誘導(dǎo)細(xì)胞病變有關(guān)，2B能增強(qiáng)膜通透性、封閉蛋白酶分泌的途徑，2C具有ATP和GTP酶的活性，2A和2C都高度保守[7-8]。有研究表明2C的中央?yún)^(qū)包含核苷三磷酸(NTP）結(jié)合蛋白的特征性基序，AGXXXGKS/T，參與同NTP磷酸基的結(jié)合[9-10]。本研究的R株致弱后兩個(gè)蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列均沒(méi)有變化，但在中央?yún)^(qū)并沒(méi)有找到該特征性基序，而在第110位有GKSGQGKS序列。

P3中3A高度保守，其變異與宿主范圍改變有關(guān)；研究表明，口蹄疫所在科屬病毒的3B蛋白都是通過(guò)保守的第3位酪氨酸殘基連接到RNA上的[11]；3C具有蛋白酶活性，參與關(guān)閉宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯；3D為依賴于RNA的RNA聚合酶，與已知的所有DNA和RNA聚合酶具有同源性，3D中有一個(gè)高度保守的以兩個(gè)天冬氨酸殘基為中心的氨基酸疏水區(qū)基序YGDD[12]。本研究中強(qiáng)弱毒株推導(dǎo)的氨基酸序列3B第3位均為保守的酪氨酸Y。強(qiáng)弱毒株的序列分析表明3A的氨基酸序列變化最大，同樣屬于缺失10個(gè)氨基酸的豬流行株，推導(dǎo)出的143氨基酸中，致弱后7個(gè)發(fā)生突變，主要發(fā)生在3A基因的后半部分，突變的位置沒(méi)有明顯的規(guī)律性，均為間斷性的點(diǎn)突變，這可能與該毒株長(zhǎng)期傳代和適應(yīng)新宿主有關(guān)。

本研究對(duì)FMDV R株及其致弱毒株R304分別進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定及分析，結(jié)果表明：致弱后R304株2A和2C的氨基酸序列都沒(méi)有發(fā)生變化，而3A的氨基酸序列變化最大，這可能與FMDV長(zhǎng)期傳代致弱有關(guān)；其次，LP和VP1的氨基酸變化也相對(duì)較大，但VP1上的幾個(gè)重要的抗原位點(diǎn)都沒(méi)有變化，提示致弱后病毒可能仍保留較好的抗原性。

本研究首次報(bào)道了長(zhǎng)期傳代致弱FMDV的基因組變化與功能的潛在關(guān)系，從基因水平上揭示了FMDV的變異趨勢(shì)和進(jìn)一步致弱改良的潛能，對(duì)FMDV的分子流行病學(xué)和功能基因組學(xué)有重要的參考價(jià)值。

[1]Peter W.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J].Virus Res,2003,91:19-32.

[2]Acharya R,Fry E,Stuart D,et al.The three-dimensi-onal structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution[J].Nature,1989,337:709-716.

[3]Verdaguer N,Sevilla N,Valero M L,et al.A similar pattern of interaction for different antibodies with a m-ajor antigenic site of foot-and-mouth disease virus:im-plications for intratypic antigenic variation[J].Virology,1998,72:739-748.

[4]Pierschbacher M D,Ruoslahti E.Variants of the cell recognition site of fibronectin that retain attachment-pr-omoting activity[J].Proc Natl Acad Sci.USA,1984,81:5985-5988.

[5]Sangar D V,Newton S E,Rowlands D J,et al.All f-ootand-mouth disease virus serotypes initiate protein synthesis at two separate AUGs[J].Nucleic Acids Res.1987,15:3305-3315.

[6]Palmenberg A C.Proteolytic processing of picornaviral polyprotein.Annu[J].Microbiology,1990,44:603-623.

[7]Doedensv J R,Kirkegaard K.Inhibition of cellular pr-otein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A[J].EMBO,1995,14:894-907.

[8]Caliguiri L A,Tamm I.Action of guanidine on the replication of poliovirus RNA[J].Virology,1968,35:408-417.

[9]Gorbalenya A E,Koonin E V.Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern[J].Nucleic Acids Res,1989,17:8413-8440.

[10]Gorbalenya A E,Blinov V M,Donchenko A P,et al.An NTP-binding motif is the most conserved sequence in a highly diverged monophyletic group of proteins involved in positive strand RNA viral replication[J].Mol Evol,1989,28:256-268.

[11]Stanway G.Review:Strcture,function and evolution of picornavirues[J].J Gen Virol.1990,71:2483-2501.

[12]Hansen J L,Long A M,Schultz S C.Structure of the RNA dependent RNA polymerase of poliovirus[J].Structure,1997,5:1109-1122.

Sequence analysis and comparison for genome of Foot-and-mouth disease virus R strain and its chickling-attenuated strain

HE Dong-sheng,LIN Xiao-min,SU Dan-ping,LUO Man-lin,LIN Shao-rong

(College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

In this study,eight DNA fragments covered the full elngth genome of Foot-and-mouth disease virus R strain and its attenuated variant were amplified by RT-PCR using specific primers.Each fragment was cloned to pMD18-T vector and sequenced.The results showed that the genome of R strain and the attenuated strain shared the same ORF of 6 966 nt which encoded for 2322 amino acid.However,there were 110 nucleotides and 32 amino acids changes in the attenuated strain,of which the 3A gene mutated most frequently,followed by the LP gene and VP1 gene ranged third.No mutations occurred in 2A gene and 2C gene.

FMDV;attenuated;genes;mutation

S852.65

A

1008-0589(2010）03-0221-04

*Correspondingauthor

2009-06-29

廣東省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(2003A20403）；廣東省農(nóng)業(yè)廳粵農(nóng)[2004]314號(hào)項(xiàng)目

賀東生(1968-），男，廣西賀州人，博士，從事獸醫(yī)傳染病學(xué)研究.Email：dhe@scau.edu.cn

(本文編輯：陳立群）