FIB基因rs6056位點單核苷酸多態(tài)性及FIB濃度與糖尿病足的相關(guān)性研究

趙靜靜，王偉靈，周麗霞，楊沁彤，張 瑩，趙延榮，邢嘉翌

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠233030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，上海200082;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科，上海200082)

糖尿病足(diabetic foot，DF)是由神經(jīng)病變、血管病變及感染三者相互作用的結(jié)果，而感染是病變加重的重要誘因，約15% ～25%的糖尿病患者會在其一生中發(fā)生足部潰瘍[1]。大量研究表明血管病變和炎癥反應(yīng)在DF發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[2]。張瑩等[3]研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)作為炎癥因子，隨著DF潰瘍嚴重程度的加重而逐漸升高，是DF發(fā)生的獨立危險因素。血漿FIB水平和分子功能的表達主要受遺傳和環(huán)境等因素的影響，其中遺傳是重要的決定因素。大量研究表明FIB β鏈的合成及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)在FIB合成過程中起主要調(diào)節(jié)作用。FIB基因啟動子區(qū)rs6056 SNP位于4q32 FGB編碼區(qū)內(nèi)，與FIB水平的升高具有相關(guān)性[4]。目前尚未有該基因SNP與DF相關(guān)性的報道。我們探討了FIB水平及FIB基因rs6056 SNP與DF的關(guān)系，為預(yù)防DF的發(fā)生提供依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

隨機選擇2013年1月至2014年3月在上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科住院的DF患者(DF組)123例，男72例，女51例，年齡(70±11)歲;同期內(nèi)分泌科住院的無足部潰瘍的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者(T2DM 組)97例，男55例，女42例，年齡(67±9)歲。篩選同期健康體檢者80名作為正常對照組，男46名，女34名，年齡(69±10)歲。糖尿病診斷標準參照美國糖尿病協(xié)會2012年發(fā)布的《糖尿病診療標準(2012版)》[5]。DF的診斷標準參照2011年國際DF工作組(International Working Group，IWGDF)發(fā)布的《糖尿病足國際臨床指南》[6]。DF的分級參照Wagner分級方法[7]。

二、病例納入和排除標準

1.納入標準 (1)符合以上診斷標準;(2)正常對照組選擇年齡和性別等與病例組相匹配的，排除高血脂、糖調(diào)節(jié)異常及臨床下肢血管病變者;(3)樣本采集過程符合倫理學(xué)要求，所有入選者均已簽署知情同意書。

2.排除標準 (1)不符合以上納入標準;(2)近半年內(nèi)有急性心肌梗死、腦梗死或出血者;(3)合并有嚴重肝、腎功能不全，心力衰竭，血液病，惡性腫瘤等疾病以及精神病患者;(4)存在其它感染性疾病者。

三、臨床資料采集

收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、糖尿病病程及體重指數(shù)(body mass index，BMI)等。

四、基因組DNA的提取

抽取入選患者外周靜脈血2 mL，嚴格按照Axy Prep全血基因組DNA試劑盒說明書的操作步驟進行DNA提取。

五、基因多態(tài)性檢測

應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)法(polymerase chain reaction-ligation detection reaction，PCR-LDR)檢測 FIB基因 rs6056(ID:2244)位點的多態(tài)性。Taq酶體系購自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，上、下游引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。上游引物:5'-ACGAAGCACACGAAGGTTAG-3'，下游引物:5'-CTCAGAACTGGAAAAGCACC-3'。

1.PCR反應(yīng)體系 總體系為20μL。1×PCR緩沖液2μL，3 mmol/L Mg2+0.6μL，2 mmol/each dNTP 2μL，1 U Taq 酶 0.2μL，ddH2O 12.2μL，0.5 pmol上、下游引物模板各1μL。多重 PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性90 s，50 ℃退火90 s，65 ℃延伸30 s，循環(huán)40次;65℃再延伸10 min終止反應(yīng)。以上反應(yīng)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴增儀上進行。反應(yīng)結(jié)束后，取2μL反應(yīng)產(chǎn)物在3%瓊脂糖膠、0.5×TBE中電泳，檢測反應(yīng)的特異性。剩余樣本保存于-20℃。

2.PCR產(chǎn)物的連接酶檢測反應(yīng)體系 總體系為10μL。1×PCR 緩沖液 1μL，probe mix(each)1μL，Taq DNA 連接酶0.05μL，ddH2O 4μL，PCR產(chǎn)物4μL。95 ℃變性2 min，94 ℃延伸15 s，50 ℃退火25 s，循環(huán)40次。以上反應(yīng)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴增儀上進行。

3.基因測序 取多重PCR-LDR產(chǎn)物1μL，加1μL ABI GS-500 ROX熒光標記分子量標準和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，進行電泳，在3730XL DNA Analyzer測序儀(Applied Biosystems/HITACHI，ABI)上進行測序。應(yīng)用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

六、實驗室其他指標的檢測

FIB采用CAI500全自動血凝儀(日本Sysmex公司)及 Dade Behring公司試劑檢測;白細胞(white blood cell，WBC)計數(shù)采用 SYSMEX XE-2100全自動血液分析儀及配套試劑檢測(日本Sysmex公司);空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)PG)、餐后2 h血糖(2 hour postprandial blood glucose，2 hPG)使用Roche公司試劑(葡萄糖氧化酶比色法)，在HITACHI 7600-020全自動生化分析儀(日本日立公司)上測定，糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C，HbA1C)采用D-10糖化血紅蛋白分析儀(Bio-Rad公司)檢測，所有操作均嚴格按照說明書進行。

七、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析?；蛐汀⒌任换蝾l率及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測采用 SHEsis(http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析。如符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，則表明研究對象是來自同一群體，具有較好的代表性。各組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以野生型純合子CC作為對照，采用非條件Logistic回歸計算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，用以說明不同基因型和等位基因與DF的發(fā)病風(fēng)險。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，方差齊性資料采用LSD檢驗，方差不齊資料采用Tamhane’s T2(M)檢驗。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計推斷。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組間基本資料的比較

DF組WBC和FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組(P＜0.05)，DF組病程較T2DM組長(P＜0.05)。3組間年齡及性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)

表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與 T2DM 組比較，#P ＜0.05

組別 例數(shù) 年齡(歲) 病程(年) FPG(mmol/L) WBC(×109/L) FIB(g/L)DF 組 123 70 ±11 14.72 ±8.32# 8.06 ±3.82* 8.31 ±6.84*# 3.95 ±1.20*#T2DM 組 97 67 ±9 10.11 ±7.73 8.44 ±3.79* 6.38 ±1.65 2.81 ±0.75*正常對照組80 69 ±10 - 5.47 ±0.48 5.83 ±1.53 2.15 ±0.81

二、DF組不同Wagner分級相關(guān)指標的比較

根據(jù)Wagner分級將DF組分為0～Ⅲ級(57例，男33例、女24例)、Ⅳ級(56例，男33例、女23例)、Ⅴ級(10例，男6例、女4例)。WagnerⅤ級患者WBC和FIB水平均明顯高于WagnerⅣ級和Wagner 0～Ⅲ級患者(P均＜0.05);3組間年齡、病程及 BMI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均 ＞0.05)。見表2。

表2 DF組不同Wagner分級相關(guān)指標的比較 (±s)

表2 DF組不同Wagner分級相關(guān)指標的比較 (±s)

注:與0～Ⅲ級組比較，*P ＜0.05;與Ⅳ級組比較，#P ＜0.05

Wagner分級 例數(shù) 年齡(歲) 病程(年) BMI(kg/m2) WBC(109/L) FIB(g/L)8 ±0.95Ⅳ級組 56 70 ±12 14.50 ±8.26 23.54 ±4.64 8.88 ±9.43* 4.33 ±1.08*Ⅴ級組 10 66 ±12 16.30 ±7.86 21.18 ±3.55 13.56 ±3.90*# 5.63 ±0.36*#0 ～ Ⅲ級組 57 70 ±11 14.63 ±8.59 23.29 ±3.57 6.81 ±1.98 3.2

三、FIB基因rs6056位點基因型及等位基因的判斷

1.FIB基因rs6056位點基因型及等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測，各組樣本間rs6056位點基因型及等位基因頻率分布均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=0.102、0.546、0.595，P ＞0.05)，具有群體代表性。DF 組及T2DM組基因型及等位基因頻率分布與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。DF組Wagner不同分級間基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)。見表3、表4及圖1。

2.不同基因型間FIB水平比較 DF組TT基因型FIB水平明顯高于CC和CT基因型(P＜0.05);T2DM組TT基因型 FIB水平高于CC和CT基因型(P＜0.05)，而CC和CT基因型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表5。DF患者中Wagner 0～Ⅲ級組TT和CT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P＜0.05)，WagnerⅣ級組TT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P＜0.05)。正常對照組及 DF組 WagnerⅤ級3種基因型間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 見表6。

表3 DF組、T2DM組及正常對照組FIB基因rs6056位點基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]

表4 DF組不同Wagner分級FIB基因rs6056位點基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]

圖1 FIB基因rs6056位點3種基因型的波峰圖譜

表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s，g/L)

表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s，g/L)

注:與CC基因型比較，*P＜0.05;與 CT基因型比較，#P ＜0.05

組別FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型DF 組 3.61 ±1.15 4.16 ±1.17* 4.92 ±0.97*#T2DM 組 2.65 ±0.59 2.87 ±0.80 3.43 ±0.98*#正常對照組2.14 ±0.87 2.15 ±0.58 2.54 ±1.17

表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)

表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)

注:與CC基因型比較，*P＜0.05

DF患者Wagner分級FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型0 ～ Ⅲ級組 2.99 ±0.79 3.55 ±1.10* 4.07 ±0.53*Ⅳ級組 4.04 ±1.08 4.66 ±0.91 5.29 ±0.73*Ⅴ級組5.63 ±0.30 5.56 ±0.42 5.82 ±0.40

3.單因素Logistic回歸分析 采用非條件Logistic回歸進行基因型和等位基因頻率的相對風(fēng)險分析，以疾病分類為因變量，危險因素為自變量。結(jié)果顯示 WBC、FIB、CT基因型和TT基因型、T等位基因為DF的危險因素。見表7。

表7 DF組和正常對照組單因素Logistic回歸分析

4.多因素Logistic回歸分析 對以上有差異的指標進行多因素Logistic回歸分析，在校正了WBC和FIB等混雜因素后，發(fā)現(xiàn)TT基因型和T等位基因均不是DF發(fā)生的獨立危險因素。

討 論

DF是T2DM最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。FIB既是一種凝血因子，也是一種炎癥因子。血液中的FIB水平既可以反映血管病變的炎癥過程及內(nèi)皮功能紊亂，又可以直接參與動脈粥樣硬化，是糖尿病血管病變的危險因素。SNP在基因組中的分布相當廣泛，SNP堿基位點的改變可導(dǎo)致疾病的易感性，且FIB水平直接受遺傳因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)FIB編碼區(qū)的SNP可以導(dǎo)致FIB結(jié)構(gòu)或功能的異常，且與多種疾病相關(guān)[8]。因此，探討炎癥因子及其SNP與DF的相關(guān)性具有重要意義。

長期的糖脂代謝紊亂損害血管內(nèi)皮細胞的功能，刺激各種活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致凝血功能的紊亂和長期炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示DF組患者FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組，DF WagnerⅤ級患者FIB和WBC水平也顯著高于WagnerⅣ級和Wagner 0～Ⅲ級患者。朱平等[9]的研究顯示，DF潰瘍的發(fā)生與FIB水平密切相關(guān)，F(xiàn)IB每增加1個單位，發(fā)生潰瘍的相對危險度增加2.51倍，提示FIB可能是DF潰瘍的一個獨立危險因素。MESA等[10]發(fā)現(xiàn)DF潰瘍者FIB水平高于DF無足潰瘍者，且FIB水平與DF截肢具有相關(guān)性，降低FIB水平可以降低DF截肢率。由此可見DF患者體內(nèi)存在高炎癥反應(yīng)，提示臨床治療中應(yīng)監(jiān)測FIB水平，以達到預(yù)防的目的。

國外文獻報道，F(xiàn)IB基因rs6056 SNP位點突變可以促進FIB水平的升高，且與血栓性疾病有相關(guān)性[4]。但有關(guān)FIB基因rs6056 SNP與DF的相關(guān)性研究目前國內(nèi)外均未見報道。本研究通過對FIB基因rs6056位點SNP與DF的相關(guān)性研究，顯示3組間基因型和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。對基因型和等位基因頻率進行Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)TT基因型是DF發(fā)生的遺傳危險因素，以CC基因型攜帶者患DF的風(fēng)險定為標準數(shù)1，則TT基因型的攜帶者患DF的風(fēng)險增加為5.714，提示 FIB基因rs6056位點SNP與DF的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本研究觀察了FIB基因rs6056位點對血漿FIB水平的影響，發(fā)現(xiàn)DF組TT基因型的FIB水平均明顯高于CC和CT基因型。FIB基因啟動子區(qū)rs6056位點SNP的變化可能促進了FIB的轉(zhuǎn)錄和表達，進而增加DF的發(fā)病風(fēng)險。這些研究也從基因水平證實了炎癥參與了DF的發(fā)生，強調(diào)炎癥在DF發(fā)病中的作用，為DF的抗炎治療提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。本研究進一步顯示 DF Wagner分級間基因型和等位基因間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，DF WagnerⅤ級3種基因型間FIB水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示該基因型SNP雖然與DF發(fā)病的易感性有關(guān)，但與DF病變程度無相關(guān)性?？赡茉驗镕IB作為炎癥因子，其血漿水平受多種因素的影響，除受自身β鏈的遺傳因素影響外，還受其他基因和/或非基因因素如炎癥因子及藥物等的影響。

綜上所述，通過對FIB基因SNP的研究，為進一步了解FIB基因位點與疾病的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。由于DF是一種多基因及環(huán)境因素聯(lián)合作用的復(fù)雜疾病，本研究的樣本量較少，故本研究的結(jié)論尚應(yīng)在大樣本中做進一步研究，尋找更多的證據(jù)加以驗證。

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