早產(chǎn)胎盤(pán)組織中差異表達(dá)基因的研究

孫 健，汪 云，陶建英，陳 瑛(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科，蘇州 500;南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院新生兒科;通訊作者，E-mail:cyandzh@sohu．com)

早產(chǎn)是指妊娠不足37周而分娩［1］，是一種常見(jiàn)、重要且復(fù)雜的妊娠并發(fā)癥，能顯著增加產(chǎn)褥期并發(fā)癥以及新生兒的各種疾病和病死率，約75%的圍產(chǎn)兒死亡與早產(chǎn)有關(guān)［2］。全世界每年約1 490萬(wàn)早產(chǎn)兒降生，約占總新生兒的11．1%，而且比例有不斷上升的趨勢(shì)［3］。目前研究認(rèn)為，早產(chǎn)是多種因素相互作用所致的一種綜合征，年齡、孕產(chǎn)史、不良行為、感染、遺傳因素、炎癥、宮縮和子宮頸長(zhǎng)度等與早產(chǎn)相關(guān)［4，5］，但是早產(chǎn)發(fā)生的確切機(jī)制還不明確。隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)基因的異常表達(dá)是引起早產(chǎn)的重要原因。Chim等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，孕晚期母親血清中基因的差異表達(dá)導(dǎo)致早產(chǎn)。而有關(guān)早產(chǎn)胎盤(pán)中基因表達(dá)譜的研究還很少，所以本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)通過(guò)對(duì)早產(chǎn)的胎盤(pán)組織及足月產(chǎn)胎盤(pán)組織進(jìn)行基因表達(dá)譜的檢測(cè)及qRT-PCR驗(yàn)證，旨在篩選及確定與早產(chǎn)相關(guān)的基因，從而為早產(chǎn)的預(yù)防、診斷提供新的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1．1 材料來(lái)源與分組

選擇2013-02～2013-10在南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科常規(guī)產(chǎn)前檢查并且早產(chǎn)的早產(chǎn)兒16例為病例組，參照第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取同期的健康足月產(chǎn)兒20例為對(duì)照組，獲取兩組胎盤(pán)組織作為研究材料。兩組均為單胎妊娠，年齡20-40歲的初產(chǎn)婦或經(jīng)產(chǎn)婦，排除原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病、心臟病、前置胎盤(pán)等內(nèi)外科疾病及產(chǎn)科并發(fā)癥，兩組孕婦詳細(xì)情況見(jiàn)表1。所有孕婦均已簽署知情同意書(shū)，方案通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組孕婦及其新生兒一般情況比較Table 1 Comparison of general data of pregnant women and neonates between two groups

1．2 胎盤(pán)標(biāo)本采集

標(biāo)本采集于胎盤(pán)娩出后5 min內(nèi)迅速完成。于胎盤(pán)胎兒面，避開(kāi)鈣化點(diǎn)，在胎盤(pán)不同區(qū)域剪取數(shù)塊胎盤(pán)組織，每塊約1 cm見(jiàn)方，經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過(guò)的PBS漂洗2次，在濾紙上去除水分，分裝于凍存管內(nèi)，迅速置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。

1．3 總RNA的提取

采用總RNA抽提試劑盒(QIAGEN’s RNeasy)，參照生產(chǎn)商的步驟提取胎盤(pán)組織總RNA。用分光光度計(jì)Nano Drop ND-1000測(cè)定RNA的濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，RNA中無(wú)DNA、無(wú)蛋白質(zhì)污染、無(wú)明顯降解，可用于基因芯片檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)。

1．4 基因芯片的雜交、清洗及掃描

病例組中隨機(jī)選取9例，對(duì)照組中隨機(jī)選取4例進(jìn)行基因芯片分析，采用芯片為GeneChip Primeview Human Gene Expression Array(Affymetrix公司)。每例樣本取500 ng總RNA，使用IVT express kit(Affymetrix公司)擴(kuò)增標(biāo)記 cRNA，取15 μg標(biāo)記好的cRNA，配制成 cocktail，加入芯片中于 Hybridization Oven 640(Affymetrix公司)中45℃雜交16 h，雜交好的芯片在FS450全自動(dòng)洗滌工作站(Affymetrix公司)上洗滌染色，用GeneChip?scanner7G(Affymetrix公司)掃描芯片并通過(guò)AGCC軟件得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Expression Console軟件(Affymetrix公司)得到質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)。

1．5 芯片數(shù)據(jù)分析

采用商業(yè)軟件Partek GS 6．5進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)分析，去掉弱信號(hào)(信號(hào)值＜400)后，用各個(gè)樣本雜交信號(hào)值的中位值進(jìn)行歸一化處理，篩選差異表達(dá)基因，采用國(guó)際上通用的基因功能分析法，即基因本體(gene ontology，GO)功能注釋分析法和KEGG通路分析法，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與分析。

1．6 qRT-PCR 驗(yàn)證

從芯片篩選到的差異表達(dá)的基因中，選擇可能具有一定臨床意義的基因在所有的樣本中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(包括做基因芯片的樣本)。提取的每例樣本的總RNA通過(guò)HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Vazyme)在 ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法分析病例組及對(duì)照組胎盤(pán)組織中基因mRNA的表達(dá)，使用2-ΔΔCt法分析所選基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

芯片結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11．7進(jìn)行分析，組間差異采用t檢驗(yàn)(two-tailed)，其中2倍以上變化，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)每組樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)3遍。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11．7進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)(two-tailed)，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 基因芯片結(jié)果

基因芯片包含了條36 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本的信息，根據(jù)該芯片的結(jié)果，將病例組和對(duì)照組的表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，其中2倍以上變化并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義認(rèn)為是差異表達(dá)的基因。符合條件的基因共有75個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有66個(gè)。PSG9是上調(diào)倍數(shù)最多的基因，而LEP則為下調(diào)倍數(shù)最多的基因(見(jiàn)表2)，聚類分類圖見(jiàn)圖1。

圖1 4例對(duì)照胎盤(pán)組織和9例病例組胎盤(pán)組織差異表達(dá)基因聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis of 75 differentially expressed genes in placentas from 4 control placentas and 9 preterm placentas

表2 基因芯片檢測(cè)的人早產(chǎn)胎盤(pán)差異表達(dá)基因Table 2 Differentially expressed genes in placental tissues of the preterm neonates detected by microarray

2．2 GO功能注釋分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)75個(gè)差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO功能注釋分析以及KEGG通路分析。GO功能注釋分析結(jié)果:差異表達(dá)基因主要參與抗原加工提呈、免疫應(yīng)答、傷害應(yīng)答和系統(tǒng)進(jìn)程的調(diào)節(jié)等信號(hào)途徑，篩選出的GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見(jiàn)表3。KEGG通路分析結(jié)果:將差異顯著基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢，設(shè)定P＜0．05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，差異表達(dá)基因中有全身性紅斑狼瘡相關(guān)、哮喘相關(guān)、同種異體移植物排斥相關(guān)、移植物抗宿主相關(guān)等信號(hào)通路相關(guān)作用的基因，篩選出的生物學(xué)通路名稱及其基因數(shù)見(jiàn)表4。

表3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋結(jié)果Table 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

表4 差異表達(dá)基因的KEGG通路及其基因數(shù)Table 4 KEGG pathways and gene numbers of differentially expressed genes

2．3 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果

選取芯片中表達(dá)有差異的4個(gè)基因:妊娠特異性β-1糖蛋白9(PSG9)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、人妊娠相關(guān)血漿蛋白2(PAPPA2)和抑制素β-A(INHBA)，以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為對(duì)照基因，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)在16例病例組胎盤(pán)和20例對(duì)照組胎盤(pán)中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，PSG9基因在病例組胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)1．82倍;而CRH、PAPPA2和INHBA基因在病例組中的表達(dá)水平低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比分別表達(dá)下調(diào)3．28倍、2．98倍和2．19倍，其結(jié)果與基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果基本相符(見(jiàn)表5)。

表5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

表5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

基因 相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組(n=20) 病例組(n=16)變化倍數(shù)P PSG9 2．05 ±1．21 3．73 ±1．54 +1．82 ＜0．05 CRH 0．92 ±0．63 0．28 ±0．13 -3．28 ＜0．01 PAPPA2 1．03 ±0．32 0．35 ±0．16 -2．98 ＜0．05 INHBA 0．55 ±0．37 0．25 ±0．14 -2．19 ＜0．05

3 討論

早產(chǎn)所致的圍生兒發(fā)病率、病死率以及后遺癥問(wèn)題已成為一個(gè)世界性的衛(wèi)生問(wèn)題，然而早產(chǎn)的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能通過(guò)遺傳和環(huán)境的相互作用而發(fā)病，臨床上尚缺乏有效的對(duì)因防治措施［7］，因此找到早產(chǎn)的致病基因，從基因水平上預(yù)防治療早產(chǎn)十分重要?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)是鑒定疾病相關(guān)基因的有力工具［8］，在產(chǎn)科相關(guān)疾病中有著廣泛的應(yīng)用［9，10］。本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)從早產(chǎn)胎盤(pán)中鑒定出75個(gè)差異表達(dá)的基因，并對(duì)芯片中有顯著差異表達(dá)的4個(gè)基因(PSG9、CRH、PAPPA2和INHBA)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)，其結(jié)果與基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果基本相符。

PSG9是妊娠特異性糖蛋白(PSG)家族中的一員，在GO功能注釋中參與防御應(yīng)答，PSG是在人類懷孕期間母體血液中含量最豐富的滋養(yǎng)層蛋白質(zhì)。有文獻(xiàn)表明低PSGs血清濃度與生長(zhǎng)受限有關(guān)系［11］，部分文獻(xiàn)報(bào)道異常低濃度的PSGs與先兆子癇有關(guān)，但是也有研究表明異常低濃度的PSGs與先兆子癇沒(méi)有關(guān)系［11，12］，另外宮內(nèi)孕和宮外孕PSGs的表達(dá)差異可以作為宮外孕臨床檢測(cè)的標(biāo)記物［13］。但是PSG9與早產(chǎn)的關(guān)系還鮮有報(bào)道，我們的結(jié)果表明PSG9在早產(chǎn)胎盤(pán)樣本中表達(dá)上調(diào)，提示可能改變機(jī)體的防御應(yīng)答功能，從而早產(chǎn)中可能發(fā)揮重要作用，有望成為早產(chǎn)預(yù)測(cè)的一個(gè)分子標(biāo)記物。

CRH在GO功能注釋中參與激素分泌的調(diào)節(jié)、防御應(yīng)答和炎癥應(yīng)答。在子宮、胎盤(pán)和卵巢中高表達(dá)，被認(rèn)為參與妊娠的蛻膜化，胚胎植入和正常的懷孕過(guò)程以及分娩的開(kāi)始［14］。胎盤(pán)源的CRH循環(huán)水平在孕期接近分娩時(shí)呈指數(shù)級(jí)增加，顯示CRH可能是孕期長(zhǎng)短的影響因素。與Mayor-Lynn等［15］的報(bào)道不一致，他們?cè)?名早產(chǎn)胎盤(pán)和5名足月產(chǎn)胎盤(pán)中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證得出相對(duì)于足月產(chǎn)胎盤(pán)，CRH在早產(chǎn)胎盤(pán)中過(guò)度表達(dá)。不一致的原因可能與個(gè)體差異和樣本量有關(guān)，他們一共10例，我們36例。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRH在早產(chǎn)胎盤(pán)中表達(dá)下調(diào)，可能改變了機(jī)體的激素分泌的調(diào)節(jié)、防御應(yīng)答或炎癥應(yīng)答功能，提示CRH在胎盤(pán)中表達(dá)下調(diào)可能與早產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

PAPPA2在GO功能注釋中參與生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。在人類胎盤(pán)中高表達(dá)，通過(guò)水解活性裂解胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)，PAPPA2裂解IGFBP5和可能裂解IGFBP3，因此調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子的釋放，以促進(jìn)胎兒胎盤(pán)的生長(zhǎng)。有研究表明，PAPPA2在胎盤(pán)中的異常表達(dá)可能與孕期并發(fā)癥有關(guān)，PAPPA2蛋白在孕婦的外周血中可以檢測(cè)到，因此可以用來(lái)作為胎盤(pán)異常的標(biāo)記物［16］。我們的研究結(jié)果表明PAPPA2基因在早產(chǎn)胎盤(pán)中低表達(dá)，可能抑制胎盤(pán)的生長(zhǎng)，從而在早產(chǎn)中起作用，有望成為早產(chǎn)預(yù)測(cè)的一個(gè)分子標(biāo)記物。

INHBA在GO功能注釋中參與生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)和激素分泌的調(diào)節(jié)。與α亞單位一起由二硫鍵結(jié)合而成抑制素A，抑制素A是一種異源二聚體糖蛋白，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)妊娠早期胎盤(pán)是抑制素A的主要來(lái)源，影響著妊娠的發(fā)生、發(fā)展及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明胎盤(pán)中INHBA的表達(dá)與生長(zhǎng)受限有相關(guān)性，并且在子癇前期患者的胎盤(pán)中差異表達(dá)［17］;Zahra 等［18］的研究表明，母親孕中期血清中抑制素A的升高容易引起早產(chǎn)，可以作為預(yù)測(cè)早產(chǎn)的標(biāo)記物。我們的研究結(jié)果表明INHBA基因在早產(chǎn)胎盤(pán)中低表達(dá)，而在早產(chǎn)中的功能還需要進(jìn)一步的功能研究。

本研究存在著一些不足之處。首先，本研究例數(shù)較少，雖然基因芯片檢測(cè)結(jié)果與許多文獻(xiàn)報(bào)道相符，但還需要更大樣本重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，以更準(zhǔn)確地了解早產(chǎn)胎盤(pán)的基因表達(dá)譜。其次，本研究?jī)H篩選并驗(yàn)證了早產(chǎn)的差異基因，但相關(guān)差異表達(dá)基因在早產(chǎn)中所起的作用還需要功能試驗(yàn)闡明。

綜上所述，本研究采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)到早產(chǎn)胎盤(pán)組織中存在異常表達(dá)的基因譜和信號(hào)通路，并用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了部分差異表達(dá)基因，與基因芯片檢測(cè)的結(jié)果一致，這些結(jié)果為早產(chǎn)的后續(xù)研究提供了新的思路。

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