STAT3及p-STAT3在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

喬 麗，李新技，楊志勇，張國(guó)強(qiáng)，劉 瑋(中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科，北京 004;中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院腫瘤放療科;河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科;通訊作者，E-mail:Liuwei58@6．com)

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族 (signal transduction and activators of transcription，STATs)的成員之一—Stat3，被生長(zhǎng)因子、胞外細(xì)胞因子等多肽類配體激活，在胚胎的早期發(fā)育、皮膚重建、免疫反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮重要作用，是多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道交匯點(diǎn)。近幾年的研究表明，Stat3在各種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活［1］，并且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)，而在正常組織細(xì)胞中STAT3的表達(dá)作用是快速而短暫的。STAT3及p-STAT3的表達(dá)與腫瘤分級(jí)和患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中是否也存在類似的現(xiàn)象尚不完全確定，為此本研究檢測(cè)36例皮膚鱗狀細(xì)胞癌中STAT3和p-STAT3的表達(dá)，并分析其與臨床病理的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 組織標(biāo)本

組織標(biāo)本均來自2014-2015年中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科患者，病理證實(shí)為皮膚鱗狀細(xì)胞癌，共計(jì)36例，其中男性20例，女性16例，年齡29-73歲，中位年齡51．1歲，取鱗癌組織及距腫瘤邊緣2 cm的癌旁組織約0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm。所有組織均為手術(shù)切除后獲取的新鮮標(biāo)本，組織標(biāo)本獲取后立即轉(zhuǎn)移至液氮及40 g/L多聚甲醛固定再經(jīng)HE染色證實(shí)。

1．2 主要試劑

PCR引物由北京普京康利工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，鼠抗人STAT3單克隆抗體和鼠抗人p-STAT3單克隆抗體購(gòu)于Sigma公司，Elivision二步法二抗試劑盒購(gòu)于北京德廣生生物技術(shù)有限公司。

1．3 qRT-PCR

我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了Stat3和β-actin的引物序列(見表1)，用qRT-PCR檢測(cè)鱗癌組織及癌旁組織STAT3的轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 μl體系，反應(yīng)條件為25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85℃5 min。用上述cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μl擴(kuò)增體系中包括Probe RT-Master Mix 10 μl，上下游引物及探針(20 μmol/L)各0．4 μl，RT Mix 0．2 μl，模板RNA 2 μl。擴(kuò)增條件為:60 ℃ 5 min，50 ℃ 30 min，93℃ 15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及變性;93℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 1min，進(jìn)行5個(gè)預(yù)循環(huán);然后以93℃15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，55℃時(shí)收集熒光信號(hào)。用qRT-PCR儀檢測(cè)，獲得Ct值。采用ΔCt進(jìn)行分析，Ct與mRNA表達(dá)量呈反比，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照。使用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。Stat3的mRNA 表達(dá)量變化以公式2-ΔΔCt計(jì)算，其中ΔCt為每份標(biāo)本中Stat3與β-actin的Ct值之差，而ΔΔCt為實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組ΔCt之差。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物序列Table 1 The primer sequence used in qRT-PCR analysis

1．4 免疫組化檢測(cè)鱗癌組織及癌旁組織STAT3、p-STAT3表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行操作:新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切(也可-80℃保存)，厚度為5-6 μm。載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風(fēng)吹干。如不馬上染色，可密封后-20℃保存。染色前用冷丙酮在4℃固定10-20 min。PPS沖洗5 min×2次，30 ml H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，20 min，避光;用PBS沖洗5 min×2次;正常血清封閉:從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分(保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài))，滴加正常山羊或兔血清(與第二抗體與源動(dòng)物血清)處理，37℃，15 min。正常血清配制(或按試劑盒規(guī)定的濃度配制):按1∶20比例，用PBS配制，每張切片要按50 μl+5 μl(10%拋灑量)量計(jì)算。滴加STAT3和p-STAT3鼠抗人(分別1∶100;1∶150稀釋)第一抗體:用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃2 h(也可置于4℃冰箱過夜)。PBS洗5 min×2次(置于搖床)。滴加生物素化的二抗，37℃，40 min。PBS洗5 min×2次(置于搖床)滴加三抗(SAB復(fù)合物)，37℃，40 min。PBS洗5 min×2次(置于搖床)。DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止(自來水沖終止)。

1．5 免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果判定

密封組織切片，由我院皮膚科病理組的3名醫(yī)生在顯微鏡下觀察組織切片中陽性染色情況并進(jìn)行評(píng)分。計(jì)算免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)方法是選擇每個(gè)樣品中10個(gè)非重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野中的陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分比，取平均數(shù)，連續(xù)觀察和計(jì)算至少二個(gè)條件相同的樣品，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，記數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞。記錄鱗癌組織和癌旁組織p-STAT3的臨床資料和陽性表達(dá)率，病理學(xué)特征(年齡、性別、腫瘤直徑、組織病理分級(jí))。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

在鱗癌組織和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)存在STAT3 mRNA的表達(dá)，但是鱗癌組織的STAT3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(見表2)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。

表2 Stat3 mRNA在鱗癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of Stat3 mRNA in squamous cell carcinoma tissues and adjacent tissues

2．2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

36例皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織STAT3蛋白陽性染色定位于鱗癌細(xì)胞胞質(zhì)及核周圍，呈棕褐色或者棕黃色的顆粒狀，局灶或者彌漫性分布，而鱗癌間質(zhì)中未見STAT3蛋白陽性染色(見圖1)。癌旁組織中 STAT3陽性表達(dá)率22．2%(8/36)，而鱗癌組織中陽性表達(dá)率69．0%(25/36)，癌旁組織中STAT3表達(dá)弱于鱗癌組織，陽性表達(dá)率組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。p-STAT3蛋白陽性染色定位于鱗癌細(xì)胞核內(nèi)，呈棕褐色的顆粒狀。癌旁組織中p-STAT3陽性表達(dá)率27．8%(10/36)，鱗癌組織中p-STAT3陽性表達(dá)率61．1%(22/36)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表3)。

圖1 STAT3和p-STAT3在鱗癌組織和癌旁組織的表達(dá) (×400)Figure 1 Expression of STAT3 and p-STAT3 in squamous cell carcinoma and adjacent tissues(×400)

2．3 p-STAT3表達(dá)與鱗癌病理特征關(guān)系

36例鱗癌組織中p-STAT3表達(dá)陰性和陽性組間年齡、腫瘤大小、組織病理分化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

3 討論

JAK/STAT3信號(hào)通路的激活是短暫的。生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，激活JAK蛋白，激活的JAK蛋白使STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3可形成二聚體，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)其他下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如抗凋亡基因BCL-2、cyclin D1，VEGF和MMP-2/9基因，其涉及的有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移的蛋白產(chǎn)物［2-5］。

表4 p-STAT 3表達(dá)與鱗癌臨床病理特征關(guān)系 例(%)Table 4 Relationship between expression of p-STAT 3 and clinicopathological characteristics in squamous cell carcinomacases(%)

以往研究表明，STAT3幾乎在人類主要腫瘤中均存在表達(dá)的異常，STAT3陽性表達(dá)在多種腫瘤中，與腫瘤病理分級(jí)及不良預(yù)后密切相關(guān)［6-8］。但是在國(guó)內(nèi)，人們對(duì)于皮膚鱗狀細(xì)胞癌中STAT3及磷酸化的STAT3表達(dá)狀況與鱗癌病理特征是否存在相關(guān)性尚不明確［9］，其在鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制也尚不完全明確。

本實(shí)驗(yàn)通過鱗癌組織和癌旁正常組織內(nèi)STAT3 mRNA對(duì)比，發(fā)現(xiàn)癌旁正常組織雖然存在STAT3的陽性表達(dá)，但是明顯低于鱗癌組織，說明在鱗癌組織中，存在STAT3基因的異常升高。通過免疫組織化學(xué)證實(shí)STAT3蛋白在鱗癌組織內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度以及陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，而且p-STAT3蛋白也有著相同的變化，說明在同樣存在炎性因子高表達(dá)的微環(huán)境下，癌旁組織STAT3蛋白不同于癌組織中的表達(dá)升高，STAT3的異常轉(zhuǎn)錄表達(dá)及活化可能在鱗癌組織癌變過程中扮演了重要角色。JAK/STAT3信號(hào)通路持續(xù)激活的最終結(jié)果可使細(xì)胞內(nèi)p-STAT3蛋白表達(dá)量升高，具有生物學(xué)活性的p-STAT3蛋白表達(dá)異常才可能影響諸如VEGF，survivin等影響細(xì)胞增殖侵襲的功能基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而表現(xiàn)為p-STAT3表達(dá)與患者臨床病理特征相關(guān)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p-STAT3在鱗癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，通過對(duì)比鱗癌組織中p-STAT3陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組患者的臨床特征，可發(fā)現(xiàn)兩組患者在年齡、腫瘤大小、組織病理分化有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p-STAT3陽性表達(dá)組患者腫瘤直徑大于2 cm者更多，組織病理更趨向于低分化，以上現(xiàn)象反映出p-STAT3陽性表達(dá)提示鱗癌細(xì)胞更具有增殖和侵襲的能力，惡性程度更高，由此推斷p-STAT3可能是參與鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

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