苦參堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞黏附和侵襲的抑制作用及其機(jī)制

張 悅，符喬珊(西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710075)

在發(fā)達(dá)國(guó)家Pap涂片的廣泛應(yīng)用降低了宮頸癌的發(fā)病率，但是在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌仍然位于女性腫瘤致死病因的第一位。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要原因，同時(shí)也是宮頸癌治療的困難所在。開(kāi)發(fā)有效的抗宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移新藥，對(duì)于減少宮頸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，改善宮頸癌的總體治療效果，提高宮頸癌患者的生存率意義重大，已成為宮頸癌治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中藥因其低毒性、多水平、多靶點(diǎn)和多作用互相協(xié)調(diào)的特點(diǎn)，近年來(lái)已成為抗宮頸癌藥物研究的熱點(diǎn)之一，越來(lái)越受到人們的重視和青睞?？鄥⒆鳛橐环N常用的中草藥在我國(guó)已經(jīng)有上千年的使用歷史，被認(rèn)為具有對(duì)腫瘤、病毒性肝癌和心臟疾病的治療作用?？鄥A是從中藥苦參中提取的一種單體成分［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠有效抑制結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［2，3］，但是其對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，至今仍鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及苦參堿溶液

苦參堿購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。MTT細(xì)胞增殖及活性檢測(cè)試劑、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、DMSO、Trypsin-EDTA溶液、蛋白分子量標(biāo)記、細(xì)胞裂解液、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)抗體和PVDF膜購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CollagenⅠ購(gòu)于Bio-Rad公司。兔抗人 MMP-2、MMP-9、p38和 p-p38購(gòu)于 Cell Signal公司，GADPH購(gòu)于Santa Crus公司。

利用100%DMSO配制苦參堿母液，原液濃度為60 mg/ml，儲(chǔ)存溫度為4℃。所有試驗(yàn)中用藥均采用RPMI1640培養(yǎng)基現(xiàn)用現(xiàn)配的方法，所有培養(yǎng)液中DMSO的終濃度均小于0．1%。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌HeLa細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保有。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。細(xì)胞在溫度為37℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3 d換液一次，細(xì)胞融合率達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1．3 MTT 試驗(yàn)

本研究利用MTT試驗(yàn)檢測(cè)苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，配成濃度為5×104個(gè)/ml懸液接種于96孔板中，每孔接種量為100 μl。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)6 h后，利用含有苦參堿藥物的溶液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，藥物濃度為(0．2，0．4，0．6，0．8，1．0 和 1．5 g/L)或 10 μl RPMI1640(對(duì)照組)。其后96孔板中每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，然后置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)4 h。在加入DMSO后于酶標(biāo)儀中選取570 nm進(jìn)行讀數(shù)。抑制率計(jì)算公式為:抑制率(IR)=(1-治療組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1．4 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

96 孔板中每孔加入 50 μl Collagen Ⅰ(20 μg/ml)，37℃孵育1 h，其后用含有20 g/L BSA的RPMI1640培養(yǎng)基37℃封閉30 min。苦參堿(0，0．05，0．1，0．2，0．4，0．6 和 0．8 g/L)處理 HeLa 細(xì)胞 24 h后，胰酶消化后用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為8×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，然后接種于96孔板中，每孔100 μl。37℃培養(yǎng)1 h后，PBS洗滌2次，加入50 μl MTT并37℃孵育4 h，吸棄MTT加入 DMSO 200 μl。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)讀取OD值。

1．5 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后利用血清濃度為2%的培養(yǎng)基制成5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度黃芩素的細(xì)胞懸液0．4 ml，下室中加入血清濃度為10%的常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，用棉簽去除上室中殘留細(xì)胞并對(duì)小室底部的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1．6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)苦參堿對(duì)MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄的影響

Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，根據(jù)TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Gene-specific primer pairs used for real-time PCR

1．7 免疫印跡試驗(yàn)

苦參堿處理HeLa細(xì)胞24 h，常規(guī)消化細(xì)胞后冰PBS洗滌兩次，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心提取蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并根據(jù)蛋白提取物濃度確定上樣量。每次試驗(yàn)之前將蛋白煮沸變性、然后在SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量調(diào)整電泳時(shí)間和電壓，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)配置一抗?jié)舛?，然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4℃搖床過(guò)夜。次日PBST洗膜三次，然后常溫封閉相應(yīng)二抗1 h、再次用PBST洗滌三次，最后一次用PBS洗滌，洗滌時(shí)間均為15 min。最后利用成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果圖像進(jìn)行采集，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用

本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖，隨著苦參堿濃度的升高，其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到0．8 g/L時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0．05，見(jiàn)圖1)。

2．2 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞黏附能力的影響

為了檢驗(yàn)苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞黏附能力的影響，我們將HeLa細(xì)胞接種于包被有CollagenⅠ的96孔板中，其后用不同濃度苦參堿(0．05，0．1，0．2，0．4，0．4，0．6和0．8 g/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，隨著苦參堿濃度的增加細(xì)胞的黏附能力逐漸降低，當(dāng)苦參堿的濃度達(dá)到0．4 g/L時(shí)差異出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，見(jiàn)圖2)。

圖1 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 1 The inhibition effect of matrine on the proliferation of HeLa cells

2．3 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

本研究前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，在濃度高于0．8 g/L時(shí)，苦參堿能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖。為此我們選擇低于0．8 g/L濃度的苦參堿作為檢測(cè)其抗侵襲能力的實(shí)驗(yàn)濃度，以消除其抗增殖能力對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。Transwell小室的結(jié)果顯示在低于細(xì)胞毒性濃度的情況下，苦參堿能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的侵襲(P ＜0．05，見(jiàn)圖3)。

圖2 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞黏附能力的抑制作用Figure 2 The inhibition effect of matrine on the adhesion of HeLa cells

圖3 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響Figure 3 The inhibition effect of matrine on the invasion of HeLa cells

2．4 苦參堿對(duì)MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄的影響

為了進(jìn)一步探討苦參堿抑制HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了苦參堿對(duì)MMP-2和MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠在mRNA水平明顯抑制MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)圖4)。

2．5 苦參堿對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄的影響Figure 4 The effect of matrine on the expression of MMP-2 and MMP-9 at mRNA level in HeLa cells

同2．4我們檢測(cè)了苦參堿對(duì)HeLa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠明顯抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平，這種作用隨著苦參堿濃度的升高明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)圖5)。

圖5 苦參堿對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響Figure 5 The effect of matrine on the expression of MMP-2 and MMP-9 at protein level in HeLa cells

2．6 苦參堿對(duì)p38磷酸化水平的影響

進(jìn)一步檢測(cè)苦參堿對(duì)p38信號(hào)通路活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠明顯抑制p38信號(hào)通路的活性。隨著苦參堿濃度的升高p38的磷酸化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)圖5)。

圖6 苦參堿對(duì)p38信號(hào)通路活性的影響Figure 6 The effect of matrine on the activity of p38 signal pathway

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)掃描和早期診斷的發(fā)展，其發(fā)病率和死亡率在過(guò)去40年中顯著下降［4，5］。宮頸癌臨床早期階段，多采用子宮切除或初級(jí)放療的治療方法，然而很多病例在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展到晚期階段，其中大約35%為區(qū)域轉(zhuǎn)移、10%為遠(yuǎn)距轉(zhuǎn)移。雖然近年來(lái)輔助化療和放療技術(shù)有了顯著發(fā)展，但宮頸癌的1年復(fù)發(fā)率仍然為50%，2年復(fù)發(fā)率為35%-80%。

本研究的結(jié)果顯示，苦參堿能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，且低于細(xì)胞毒性濃度的苦參堿能夠有效降低宮頸癌細(xì)胞的黏附和侵襲能力，提示苦參堿很有可能會(huì)成為一種有效的抗宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物。在腫瘤突破基質(zhì)過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶等分子發(fā)揮著重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組進(jìn)化上高度保守的鋅離子依賴蛋白水解酶，它可降解上皮細(xì)胞基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤突破基底膜以及細(xì)胞基質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。MMP-2又稱明膠酶A，在惡性程度高的腫瘤組織中呈高表達(dá)［6］，腫瘤細(xì)胞可分泌MMP-2特異性降解細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠和纖維蛋白等成分，最終導(dǎo)致基底膜破壞和腫瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)。研究發(fā)現(xiàn)抑制MMP-2的表達(dá)能夠降低宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［7］。MMP-9又稱明膠酶B，也具有降解明膠，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原以及彈力纖維的能力，它可降解完整的基底膜。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］?？傊?，MMP-2和MMP-9在宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，阻斷或者降低二者的表達(dá)必然能夠減少宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生［9］，而本研究的結(jié)果顯示苦參堿能夠有效降低MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，這提示苦參堿的抗宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用，可能與其對(duì)二者表達(dá)的抑制相關(guān)。

p38信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)p38信號(hào)通路能夠有效活化下游多種靶點(diǎn)的表達(dá)與活化，其中就包括MMP-2和 MMP-9［10，11］。此外，p38 信號(hào)通路能夠通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9啟動(dòng)子位點(diǎn)的活性調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［12］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠降低HeLa細(xì)胞中p38的磷酸化水平，提示其對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用可能是通過(guò)對(duì)p38信號(hào)通路活性的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，苦參堿對(duì)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，可能是通過(guò)抑制p38信號(hào)通路的活性進(jìn)一步抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究的結(jié)果提示，苦參堿具有明確的抗宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移作用，提示苦參堿有望成為一種有效的抗宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移藥物，為宮頸癌的治療帶來(lái)新的曙光。

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