雙歧桿菌插入失活載體的構建

崔 佳，萬翠香(長治醫(yī)學院微生物學教研室，長治 046000;南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室;通訊作者，E-mail:cuixiangwan@ncu．edu．cn)

插入突變是研究功能基因組學的一種重要方法，可為確定基因的功能提供最直接的證據(jù)［1］。本文應用的是質粒介導的插入突變，它是研究微生物功能基因組學的一種常用方法，其原理是將不能自主復制的自殺性質粒轉化入宿主，與宿主基因進行同源重組，達到對特定基因的改造或失活，進而開展基因功能的研究［2，3］。

自2006年雀巢公司發(fā)現(xiàn)在雙歧桿菌NCC2705中存在絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin(serine protease inhibitor)以來，先后在短雙歧桿菌210B中也發(fā)現(xiàn)Serpin蛋白［4］，然而關于Serpin蛋白在原核生物特別是在雙歧桿菌中的功能鮮見研究報道［5-7］。在本實驗室前期工作中，葉若松等［8］通過PCR擴增和Southern印跡雜交的方法發(fā)現(xiàn)B．bifidum WBBI02中存在serpin，將其連接入克隆載體pMD18-T和表達載體pET22b(+)，使serpin在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達，且進行了體外黏附功能研究。本實驗利用前期構建的質粒pMD18-T/serpin在serpin基因片段的SacⅡ酶切位點插入氯霉素抗性基因cmr，構建出雙歧桿菌pMD18-T/serpin-cmr插入失活質粒，為后續(xù)篩選雙歧桿菌serpin突變株逆向研究serpin功能做準備。

1 材料與方法

1．1 菌株與質粒

菌株:E．coli．DH5α(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏)。質粒:pMD18-T/serpin質粒(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室前期構建);pNZ44質粒(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏)

1．2 主要試劑與儀器

SacⅡ內切酶、CIAP去磷酸化酶均購自于TaKa-Ra大連寶生物有限公司;質粒提取試劑盒購自于北京全式金生物技術有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自于北京賽百盛基因技術有限公司;PCR儀:德國Eppendorf公司;離心機:德國Thermo公司;凝膠成像系統(tǒng):美國Bio-Rad公司。

1．3 提取pMD18-T/serpin和pNZ44質粒，克隆氯霉素抗性基因cmr

采用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技術有限公司)提取pMD18-T/serpin和pNZ44質粒。根據(jù)已發(fā)表的氯霉素抗性基因序列，本實驗設計cmr基因引物，上游引物:GCCGCGGATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGAC(SacⅡ)和下游引物:GCCGCGGTTTTATAAAAGCCAGTCATTAG(SacⅡ)，對提取的pNZ44質粒的cmr基因進行PCR擴增。采用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并采用北京賽百盛基因技術有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對PCR產(chǎn)物進行回收純化。

1．4 單酶切pMD18-T/serpin和cmr，連接后篩選重組質粒pMD18-T/serpin-cmr

用SacⅡ對質粒pMD18-T/serpin進行單酶切，得到開環(huán)質粒，為防止質粒本身自連，單酶切后的質粒進行去磷酸化反應，將5＇-P轉化為5＇-OH，再按照去磷酸化體系∶樹脂=1∶1對去磷酸化后的質?；厥?。同時將PCR擴增到的cmr產(chǎn)物也經(jīng)SacⅡ酶切，酶切后回收并與pMD18-T-serpin載體進行連接，將連接體系轉入DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR驗證初步挑選出陽性克隆，再提取重組質粒pMD18-T/serpin-cmr，用SacⅡ作酶切驗證，驗證正確的質粒送往南京金斯瑞公司測序。

2 結果

2．1 pMD18-T/serpin質粒的提取和cmr的擴增結果

pMD18-T/serpin質粒提取后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結果見圖1A;cmr擴增產(chǎn)物電泳后結果見圖1B;在750 bp左右可見目的基因片段，與預期結果相符。

圖1 pMD18-T/serpin質粒提取和PCR擴增cmr電泳圖譜Figure 1 Electrophoresis of the plasmids extraction of pMD18-T-serpin and PCR amplification of cmr

2．2 載體pMD18-T/serpin酶切去磷酸化后回收檢測

為了避免pMD18-T/serpin酶切后自連，將酶切回收后的pMD18-T/serpin磷酸化處理，0．5 h后樹脂回收去磷酸化產(chǎn)物，電泳檢測回收產(chǎn)物，結果顯示，在約3 000-4 000 bp之間可見目的基因條帶(見圖2)，與預期結果一致。

圖2 去磷酸化后回收電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis of dephosphorylated products

2．3 菌落PCR驗證陽性克隆子

挑取轉化平板上的單菌落用cmr引物進行菌落PCR驗證，結果顯示，篩選的3個克隆在750 bp附近都擴增出了條帶(見圖3)，與目的基因cmr的片段長度相符合，電泳結果初步判定篩選到的菌落為陽性克隆。

圖3 菌落PCR電泳圖譜Figure 3 Electrophoresis of colony PCR

2．4 酶切驗證陽性克隆

菌落PCR驗證顯陽性的克隆再進行SacⅡ酶切驗證，電泳結果(圖4)顯示，1號泳道的克隆酶切到cmr基因，而2號泳道的克隆酶切驗證陰性。將1號泳道的陽性重組質粒測序，序列分析表明:克隆獲得的cmr基因片段為768 bp(見圖4)，與 GenBank中序列完全一致。

圖4 pMD18-T/serpin-cmr酶切鑒定電泳圖Figure 4 Electrophoresisofrecombinantplasmid pMD18-T/serpin-cmr digested by enzymes

3 討論

抗生素的廣泛使用，使得雙歧桿菌的抗藥性越來越多樣化。易發(fā)平等［9］研究報道，兩歧雙歧桿菌對氨基糖苷類和黃胺類抗生素具有抗性，而對氨芐類和氯霉素類抗生素敏感。而康小紅等［10］的研究顯示，雙歧桿菌對青霉素類、喹諾酮類抗生素也具有抗性，而對氯霉素類敏感。石晶紅［11］在對12株雙歧桿菌的藥敏性研究中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對氯霉素類抗生素敏感。因此，我們選擇以氯霉素類抗生素為標記構建插入失活載體，作為突變株的篩選標記。

功能基因組研究的一個重要內容是突變體的構建，這是因為突變體和相應的突變基因間有著直接的因果關系［12］，構建突變體庫的方法有物理和化學誘變、基因沉默、基因敲除以及插入突變等。插入突變與其他方法相比具有很多優(yōu)點，該方法利用已知的插入序列作為標記基因，直接可對未知基因進行反向研究，不必事先確定基因表達和基因產(chǎn)物［1，13］，且插入突變具有操作簡便、快捷的特點。因此，在功能基因組學研究中插入突變已成為基因初步鑒定及功能研究的首選方法［14，15］。利用插入突變進行功能基因組學研究時主要采用T-DNA、轉座子及質粒介導的插入突變等方法構建突變庫［16］，本研究即采用質粒介導的插入突變方法試圖對長雙歧桿菌中Serpin進行功能失活的研究。實驗中我們成功構建了雙歧桿菌serpin基因的插入失活載體pMD18-T/serpin-cmr，為后續(xù)通過同源重組獲得serpin突變株提供了打靶載體，進而對逆向探究雙歧桿菌Serpin蛋白的黏附功能改變奠定了工作基礎［17-19］。

［1］孟凡立，張衛(wèi)國，陳慶山，等．插入突變在功能基因組學研究中的應用［J］．生物信息學，2006，3(4):38-40．

［2］周維，付喜愛，張德顯，等．基因敲除技術的研究進展［J］．中國獸醫(yī)雜志，2015，51(3):67-69．

［3］陶果，信吉閣，肖晶，等．基因敲除技術最新研究進展及其應用［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41(29):11605-11608．

［4］Turroni F，F(xiàn)oroni E，Motherway MO，et al．Characterization of the serpin-encoding gene of Bifidobacterium breve 210B［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(10):3206-3219．

［5］Alvarez-Martin P，O’Connell-Motherway M，Turroni F，et al．A twocomponent regulatory system controls autoregulated serpin expression in Bifidobacterium breve UCC2003［J］．Appl Environ Microbiol，2012，78(19):7032-7041．

［6］Al-Horani RA．Serpin regulation of fibrinolytic system:implications for therapeutic applications in cardiovascular diseases［J］．Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2014，12(2):91-125．

［7］Roberts TH，Hejgaard J，Saunders NF，et al．Serpins in unicellular Eukarya，Archaea and Bacteria:sequence analysis and evolution［J］．J Mol Evol，2004，59(4):437-447．

［8］葉若松，黎鵬，章昭琳，等．兩歧雙歧桿菌中serpin基因的克隆、表達與功能分析［J］．中國生物工程雜志，2011，32(2):38-42．

［9］易發(fā)平，馬永平，鐘貞，等．一株新分離的人兩歧雙歧桿菌耐藥性研究［J］．中國微生態(tài)學雜志，2005，17(2):92-93．

［10］康小紅，柳翰凌．兩株雙歧桿菌藥敏性及其質粒DNA的檢測［J］．食品工業(yè)科技，2008，29(8):124-126．

［11］石晶紅．雙歧桿菌對12種抗生素的敏感性［J］．河套大學學報，2008，5(4):20-26．

［12］李今煜，陳健銘，彭振坤．幾種常用的基因敲除技術［J］．武夷科學，2007，23(1):187-189．

［13］蘇紅，印莉萍．插入突變在水稻功能基因組學中的研究進展［J］．生物技術通報，2009(5):1-4．

［14］倪銀蕓，宋光艷，錢炳俊，等．枯草芽孢桿菌rocG基因插入失活突變株的構建［J］．上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版)，2014，32(6):32-37．

［15］龐歡瑛，陳立明，黃郁蔥，等．溶藻弧菌dldh基因突變株的構建及其生物學功能研究［J］．生物技術通報，2014(10):161-167．

［16］Guglielmetti S，Mayo B，Alvarez-Martin P．Mobilome and genetic modification of bifidobacteria［J］．Benef Microbes，2013，4(2):143-166．

［17］Sangrador-Vegas A，Stanton C，van Sinderen D，et al．Characterization of plasmid pASV479 from Bifidobacterium pseudolongum subsp．globosum and its use for expression vector construction［J］．Plasmid，2007，58(2):140-147．

［18］Guglielmetti S，Ciranna A，Mora D，et al．Construction，characterization and exemplificative application of bioluminescent Bifidobacterium longum biovar longum［J］．Int J Food Microbiol，2008，124(3):285-290．

［19］Efimov BA，Shkoporov AN，Khokhlova EV，et al．Bifidobacterial plasmids and their application to genetic engineering．Vestn Ross Akad Med Nauk，2008(2):16-21．