針刺聯(lián)合紫杉醇對(duì)小鼠Lewis肺癌代謝的影響

趙宏亮，成澤東，李春日，張小卿，張志星，陳以國(guó)（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)110032）

針刺聯(lián)合紫杉醇對(duì)小鼠Lewis肺癌代謝的影響

趙宏亮，成澤東，李春日，張小卿，張志星，陳以國(guó)*通信作者：陳以國(guó)，男，博士，教授，電話－15998839950
（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng)110032）

目的 觀察針刺對(duì)體內(nèi)藥物代謝和藥物分布的影響，探討針刺特定穴位對(duì)靶器官藥物含量的影響。方法 把雌性A/J系小鼠288只隨機(jī)分為4組，每組72只，并建立模型，采用誘發(fā)小鼠肺鱗狀細(xì)胞癌造模法，分別采用針刺、藥物及針?biāo)幗Y(jié)合法對(duì)其進(jìn)行治療，對(duì)不同時(shí)間內(nèi)，不同組內(nèi)的小鼠分別進(jìn)行藥物濃度注射，處理后，提取相關(guān)臟器，采用高效液相色譜儀測(cè)定各組織器官（肺臟、肝臟、心臟）的紫杉醇濃度。結(jié)論 針刺特定穴位能增加靶器官藥物含量，提高療效。

針灸療法；紫杉醇；趨向性；肺癌；小鼠

肺癌是發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類的健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。常選紫杉醇（Paclitaxel Taxol，太平洋紫杉醇）中藥為治療癌癥的有效藥物，但是因其在臨床出現(xiàn)多種毒副反應(yīng)，如過敏反應(yīng)，骨髓抑制，神經(jīng)毒性等，故臨床對(duì)紫杉醇的使用多加以限制［1-3］。本實(shí)驗(yàn)研究針刺對(duì)體內(nèi)藥物代謝和藥物分布的影響，探索針刺特定穴位對(duì)靶器官藥物含量的影響，證實(shí)針刺“肺俞”可增加紫杉醇在小鼠肺臟及瘤體內(nèi)的含量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高治療效果［4-6］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)7周齡，雌性A/J系小鼠288只，體質(zhì)量為（20±2）g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)：（北）2012-0003］。

1.2 主要試劑及儀器 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品：上海思萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)；紫杉醇注射液：四川升和制藥有限公司生產(chǎn)，濃度為30mg/5mL；Lewis肺癌可移植性瘤株：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫教研室生產(chǎn)；乙腈、甲醇，均為色譜純，其他試劑均為分析純：四川升和制藥有限公司生產(chǎn)；HeraeusB iofuse 28RS低溫高速離心機(jī)（四川升和制藥有限公司）；DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（上海諾頂儀器設(shè)備有限公司）；KQ-100型醫(yī)用超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）；LC-10AT高效液相色譜儀（北京京科瑞達(dá)科技有限公司）；SPD-10AT可見-紫外檢測(cè)器（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司）；C-R3A數(shù)據(jù)處理機(jī)（日本島津公司）；0.25mm×30mm針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠）。

1.3 動(dòng)物分組及造模

1.3.1 動(dòng)物分組 288只小鼠隨機(jī)分為4組，每組72只。紫杉醇藥物組：腹腔注射紫杉醇；針刺肺俞組：腹腔注射紫杉醇同體積生理鹽水，針刺“肺俞”穴。針刺靈臺(tái)組：腹腔注射紫杉醇同體積生理鹽水，針刺“靈臺(tái)”穴。針刺肺俞、靈臺(tái)加紫杉醇藥物組：腹腔注射紫杉醇，針刺“肺俞”和“靈臺(tái)”穴。

1.3.2 動(dòng)物造模 采用 NTCU（N-nitroso-trischloroethylurea）誘發(fā)小鼠肺鱗狀細(xì)胞癌造模法。具體方法：室溫控制在（21±2）℃，空氣定期用紫外線消毒，墊料用高壓進(jìn)行滅菌。動(dòng)物自由飲水和攝食，飲冷開水，用每日新鮮蒸熱的標(biāo)準(zhǔn)混合飼料。小鼠背部刮毛，采用NTCU（溶解于丙酮）涂抹小鼠背部皮膚，25μL（0.04mmol/L NTCU），2次/周，每周刮毛1次，第8個(gè)月造模結(jié)束。組織學(xué)檢查確認(rèn)造模成功。

1.4 處理因素

1.4.1 針刺治療 時(shí)間：給藥前針刺。選穴：針刺肺俞組、靈臺(tái)組，其中含有“肺俞”的穴位連雙側(cè)電（電流經(jīng)體表通過，不經(jīng)過心臟，預(yù)實(shí)驗(yàn)無不良反應(yīng)），含有靈臺(tái)穴配非經(jīng)非穴（靈臺(tái)外下1 cm處），以上穴位選取參照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》取穴。方法：順經(jīng)以30°角斜刺，刺入皮下2 mm，連電極，接6805-A型電針儀，施以疏密波，頻率2 Hz，強(qiáng)度2～4mA，留針15min。1次/d，連續(xù)5次。空白組、模型對(duì)照組和紫杉醇藥物組均與施加因素組同樣捆綁在小鼠固定架上。

1.4.2 藥物治療 時(shí)間：最后1次針刺后立即給藥。根據(jù)人臨床推薦用量及不同種屬之間藥物劑量的換算法，確定小鼠的給藥劑量為紫杉醇6 mg/kg，將紫杉醇注射液用生理鹽水稀釋至0.6mg/mL，腹腔注射給藥。

1.5 取材及樣品制備

1.5.1 血漿高效液相樣品 給藥后15、30 min，分別于1、2、8、12、24 h取5只小鼠異氟醚麻醉，心臟穿刺放血處死，置肝素化塑料離心管中，離心5 000 r/min，離心5 min，分離血漿。取血漿100μL加入內(nèi)標(biāo)多烯紫杉醇（Docetaxel）25μL（1μm），醋酸銨 750μL （10 mmol/L醋酸銨溶于乙腈），渦 旋 混 合，離 心10 000 r/min，離心10min，取上清0.2μm注射器過濾器過濾，用流動(dòng)相溶液補(bǔ)足最終體積為1 mL，取20μL供血藥濃度測(cè)定。流動(dòng)相溶液組成：65％乙腈，35％ 10 mmol/L醋酸銨。

1.5.2 肺臟、心臟、肝臟組織高效液相樣品 給藥后15、30 min，分別于1、2、8、12、24 h取5只小鼠異氟醚麻醉心臟穿刺放血處死，各臟器取樣稱重，加入等體積蒸餾水研磨，取上清100μL加入內(nèi)標(biāo)多烯紫杉醇25μL（1μm），醋酸銨750μL（10 mmol/L醋酸銨溶于乙腈），渦旋混合，離心10 000 r/min，離心10 min，取上清0.2μm注射器過濾器過濾，用流動(dòng)相溶液補(bǔ)足最終體積為1mL，取20μL供藥物濃度測(cè)定。

1.5.3 肺臟、心臟、肝臟組織免疫印跡樣品 給藥后15、30min，分別于1、2、8、12、24 h取5只小鼠異氟醚麻醉心臟穿刺放血處死，取樣稱重，各臟器取樣液氮冷凍研磨，RIPA裂解液提取總蛋白。

1.6 定量分析紫杉醇濃度 高效液相色譜儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、考察日內(nèi)精密度和日間精密度、回收率測(cè)定 色譜條件：色譜柱：DiamonsilTMC18（150 mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：65％乙腈，35％10 mmol/L醋酸銨；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：100μL/min。高效液相色譜儀測(cè)定各樣品的紫杉醇濃度。藥物代謝動(dòng)力學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理使用DAS軟件確定藥物代謝動(dòng)力學(xué)模型，計(jì)算血漿和各臟器組織藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

經(jīng)線性范圍考察、精密度實(shí)驗(yàn)考察、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察、重復(fù)性試驗(yàn)考察、回收率試驗(yàn)考察，結(jié)果提示各項(xiàng)試驗(yàn)均符合有關(guān)規(guī)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 紫杉醇在 Lewis肺癌小鼠體內(nèi)肺組織中的含量 見表1。注射紫杉醇后各實(shí)驗(yàn)組肺組織中的藥物含量均在2 h時(shí)最高，而針刺肺俞穴或靈臺(tái)穴或同時(shí)針刺兩穴?？墒顾幬锖吭诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)有不同程度的升高，以同時(shí)針刺肺俞穴和靈臺(tái)穴作用最為明顯。

表1 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組肺組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

表1 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組肺組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：與藥物組比較，＃P＜0.05；與靈臺(tái)組比較，△P＜0.05；與肺俞組比較，▲P＜0.05

組別1 h 2 h 3 h紫杉醇藥物組 32.33±2.46 33.63±3.51 31.16±2.78針刺肺俞組 37.83±3.64＃ 39.35±3.41＃ 33.27±3.13＃針?biāo)庫(kù)`臺(tái)組 35.16±3.31＃ 37.26±3.67＃ 30.31±3.53＃針?biāo)幏斡犰`臺(tái)組 40.02±3.43＃△ 42.36±3.03?！鳌?7.59±3.21?！鳌?/p>

3.2 紫杉醇在 lewis肺癌小鼠體內(nèi)肝組織中的含量 見表2。藥物組肝組織中的紫杉醇含量在注射后，2 h達(dá)到高峰，之后含量逐漸下降；3個(gè)針?biāo)幗M肝組織中藥物含量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈逐漸上升趨勢(shì)，其藥物含量變化與藥物組明顯不同。

表2 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組肝組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

表2 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組肝組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：與藥物組比較，＃P＜0.05

組別1 h 2 h 3 h紫杉醇藥物組 16.53±4.01 27.05±3.32 16.42±3.61針刺肺俞組 14.93±4.72 17.96±4.56＃ 22.36±3.97針?biāo)庫(kù)`臺(tái)組 13.89±3.89 16.88±4.26＃ 23.65±4.61＃針?biāo)幏斡犰`臺(tái)組 15.58±4.62 18.36±3.97＃ 21.56±3.82＃

3.3 紫杉醇在 lewis肺癌小鼠體內(nèi)心組織中的含量 見表3。各實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間點(diǎn)心組織中紫杉醇的含量均呈下降趨勢(shì)，其中以藥物組最為明顯，2個(gè)針?biāo)幗M下降緩慢。

表3 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組心組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

表3 腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組心組織中藥物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：與藥物組比較，＃P＜0.05；與針?biāo)庫(kù)`臺(tái)組比較，△P＜0.05

組別1 h 2 h 3 h紫杉醇藥物組 24.36±3.65 17.68±3.41 11.86±3.30針刺肺俞組 14.78±2.96＃ 9.36±3.11＃ 5.61±3.32＃針?biāo)庫(kù)`臺(tái)組 15.63±2.78＃ 8.25±2.67＃ 2.35±2.97＃針?biāo)幏斡犰`臺(tái)組 13.69±3.01＃ 10.87±3.64＃ 8.93±2.69?！?/p>

3.4 腹腔注射紫杉醇后1 h各實(shí)驗(yàn)組不同組織中的藥物含量比較 在注射藥物1 h后，針?biāo)幏斡犰`臺(tái)組肺組織中紫杉醇含量明顯高于其他3組，3個(gè)針?biāo)幗M脾、肝組織中藥物含量明顯低于藥物組，而肝組織中藥物含量與藥物組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

3.5 腹腔注射紫杉醇后2 h各實(shí)驗(yàn)組不同組織中的藥物含量比較 腹腔注射藥物2 h后，針?biāo)幗M的肺組織中的紫杉醇含量明顯高于藥物組，其中以肺俞、靈臺(tái)組最為明顯；同時(shí)，3個(gè)針?biāo)幗M肝、心組織中的藥物含量明顯低于藥物組。見圖2。

3.6 腹腔注射紫杉醇后8 h各實(shí)驗(yàn)組不同組織中的藥物含量比較 針刺肺俞組在注射藥物8 h后肺組織中的紫杉醇含量仍高于藥物組，3個(gè)針?biāo)幗M肝組織中藥物含量開始明顯升高，心組織中的藥物含量開始明顯降低。見圖3。

4 討論

通過觀察藥物在小鼠體內(nèi)的分布濃度，可以發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合紫杉醇藥物組在臟器中的濃度明顯高于非針刺的藥物組的濃度。這體現(xiàn)針刺某些特定穴位，或配穴能夠使藥物趨向于特定的器官，從而產(chǎn)生靶向性或靶向作用，使藥物能充分利用，有效控制藥物的趨向性，使藥物能夠有針對(duì)的治療特定器官，減少毒副作用。實(shí)驗(yàn)表明，針刺“肺俞”配合“靈臺(tái)”穴使紫杉醇更有效的到達(dá)特定部位，增加相應(yīng)靶性器官內(nèi)的藥物濃度，從而提高療效［5-6］。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組在1 h時(shí)不同組織中的藥物含量

圖2 各實(shí)驗(yàn)組在2 h時(shí)不同組織中的紫杉醇含量

針灸在傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)理論當(dāng)中有扶正祛邪的作用，在現(xiàn)代研究當(dāng)中針灸有調(diào)整和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，其機(jī)制主要是針刺可通過穴位的外周感覺神經(jīng)或交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)等的傳入，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。通過針灸作用與藥物的雙向治療作用及與針刺的靶向作用使二者發(fā)揮了協(xié)同、增效的作用。

本實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面證明了針刺有靶向性：其一是針刺“肺俞”“靈臺(tái)”穴影響了紫杉醇在體內(nèi)的代謝，使藥物在各臟器的分布發(fā)生明顯變化；其二是給藥后觀察1～3 h的藥物濃度表明針刺“肺俞”加“靈臺(tái)”穴更能增加在肺臟的藥物濃度分布，且明顯高于其他藥物和針刺組；其三是針刺顯著影響了紫杉醇的肝臟分布和代謝。肺俞、靈臺(tái)兩穴均位于背部，屬肺臟在體表投影的范圍內(nèi)，針刺兩穴可直接促進(jìn)局部的氣血運(yùn)行，從而使到達(dá)肺臟的藥物含量增加［7-10］。另外，穴位對(duì)相應(yīng)臟腑的調(diào)整具有特異性，此種特異性與穴位所在經(jīng)絡(luò)及所屬臟腑有極大的相關(guān)性［11-14］。針刺“肺俞”和“靈臺(tái)”穴，采用高效液相技術(shù)精確分析紫杉醇在體內(nèi)各臟器和血漿藥物濃度，利用藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)針刺后紫杉醇在體內(nèi)吸收、分布、清除等代謝規(guī)律進(jìn)行分析，通過分析針刺對(duì)紫杉醇藥代動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在肺臟的分布靶向增強(qiáng)。

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Effect of acupuncture combined paclitaxel on Lewis lung cancer metabolism in m ice

ZHAO Hongliang，CHENG Zedong，LIChunri，ZHANG Xiaoqing，ZHANG Zhixing，CHEN Yiguo*
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

Objective To observe the influence of acupuncture on drug metabolism and drug distribution in vivo，and to study the effects of acupuncture at specific acupoints on drug content in targetorgans.Methods 72 female A/Jmicewere randomly divided into groups and themodelwas established.The squamous cell carcinoma of the lung inmice inducedmode method was used and themice were divided into nine groups randomly，with respective treatment of acupuncture，drugs and

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acupuncture；paclitaxel；taxis；lung cancer；mice

book=234,ebook=20

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0234－04

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.006

2014－10－10）

遼寧省科委課題（2001）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局基金項(xiàng)目（2004）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2005）。

趙宏亮（1984－），男，碩士，中醫(yī)師，主要從事針灸學(xué)研究。