不同電荷腫瘤乏氧顯像劑的合成及生物分布

黃士堂，王祥云，褚泰偉

北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，放射化學(xué)與輻射化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室，北京 100871

組織乏氧是實(shí)體腫瘤化療和放療耐受的重要原因，對組織乏氧程度的深入了解將會對腫瘤的診斷和治療提供便利[1-3]。硝基咪唑類化合物能夠在細(xì)胞內(nèi)酶(主要是黃嘌呤氧化酶)的作用下發(fā)生單電子還原，產(chǎn)生陰離子自由基。在正常細(xì)胞中，該中間體被迅速氧化成原化合物，擴(kuò)散到細(xì)胞外；在乏氧細(xì)胞中，該中間體被進(jìn)一步不可逆還原，與細(xì)胞內(nèi)組分共價(jià)結(jié)合，并滯留在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到持續(xù)性攝取的效果。因而硝基咪唑類化合物被廣泛用于靶向乏氧組織的藥物載體[4-6]。影響乏氧組織攝取的因素有很多，例如化合物的脂溶性、分子大小、電荷性質(zhì)以及氧化還原電位等[7-10]。電荷能夠影響藥物分子的溶解性、細(xì)胞穿透性、組織器官分配、細(xì)胞代謝以及體內(nèi)清除[11-12]。因此，研究不同電荷性質(zhì)的乏氧顯像劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和一定的理論意義。

本工作擬選用容易被131I標(biāo)記的酪氨酸分子骨架，偶聯(lián)乏氧靶向基團(tuán)2-硝基咪唑，再通過適當(dāng)?shù)男揎椃謩e獲得(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸甲酯(NI-Y-M)、(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸(NI-Y)和(S)-N-(3-胺丙基)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酰胺(NI-Y-A)等3種化合物，并進(jìn)行131I標(biāo)記，考察標(biāo)記物的各種性質(zhì)及其在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

2-硝基咪唑、1,3-丙二胺和N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，比利時(shí)Acros 公司；1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(Iodogen)，美國Sigma公司；L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Tyr-OMe·HCl)，吉爾生化(上海)有限公司；Na131I(無載體溶液)由中國原子能科學(xué)研究院提供。雄性昆明小鼠，(20±2)g，中國科學(xué)院動(dòng)物所；S180細(xì)胞株由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。丙烯酰氯參照文獻(xiàn)[13]合成；三乙胺和1,3-丙二胺在使用前通過蒸餾純化，其他試劑均為分析純，并未作進(jìn)一步純化。

Bruker ARX-400核磁共振譜儀，Bruker-APEX Ⅳ傅里葉高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)，瑞士Bruker公司；Waters 1525高效液相譜儀，美國Waters 公司；Radiomatic 500TR 液體閃爍計(jì)數(shù)器，美國Packard 公司；自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器，美國Perkin Elmer 公司；Simplicity 185 純水儀，美國Milipore公司；CRC-15R放射性活度計(jì)，美國Capintec 公司；DY-W1型電泳儀，北京試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 合成部分

三種2-硝基咪唑酪氨酸衍生物的合成路線示于圖1，具體操作如下。

(1)(S)-2-丙烯酰胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯 (2)

將2.31 g H-Tyr-OMe·HCl (0.010 mol)和4.0 mL Et3N(0.027 mol)溶于30 mL CH2Cl2，冰水浴下緩慢滴加0.89 mL丙烯酰氯(0.011 mol)后，室溫下攪拌16 h。分別用1 mol/L HCl(20 mL×1)、飽和NaHCO3(20 mL×1)和飽和NaCl(20 mL×1)洗滌有機(jī)相，干燥，硅膠色譜柱分離，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑(體積比為1∶1)。最終產(chǎn)品0.863 g，產(chǎn)率為34.6%。

圖1 酪氨酸衍生物的合成

(2)(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸甲酯(NI-Y-M，3)

將0.045 g 2-硝基咪唑(0.398 mmol)和0.249 g化合物2(1.00 mmol)溶于3.0 mL Et3N/CH3CN(體積比為1∶1)中，加熱回流36 h。旋干溶劑，硅膠色譜柱分離，梯度洗脫，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑(體積比為2∶1～1∶1)。最終產(chǎn)品0.056 g，產(chǎn)率為38.8%。

1H NMR δ(DMSO-d6):9.24(1H,s,—C6H4—OH),8.41(1H,d,CO—NH—),7.40(1H,s,imi-H),7.12(1H,s,imi-H ),6.90(2H,d,—C6H4—),6.62(2H,d,—C6H4—),4.52(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.32(1H,m,NH—CH—CO),3.56(3H,s,—OCH3),2.72(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.68(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C16H19N4O6[ M+H ]+:m/z理論值為363.129 91，檢測值為363.129 81。

(3)(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸(NI-Y，4)

室溫下，向0.049 g 化合物3(0.14 mmol)滴加1 mol/L NaOH溶液至全部溶解；5 min后，用6 mol/L HCl酸化至pH≈1，出現(xiàn)大量白色晶體，室溫下靜置12 h，過濾，洗滌。最終產(chǎn)品0.025 g，產(chǎn)率為53.1%。

1H NMR δ(DMSO-d6):12.65(1H,s,COOH),9.20(1H,s,—C6H4—OH),8.26(1H,d,CO—NH—),7.39(1H,s,imi-H ),7.09(1H,s,imi-H),6.91(2H,d,—C6H4—),6.62(2H,d,—C6H4—),4.51(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.30(1H,m,NH—CH—CO),2.70(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.67(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C15H17N4O6[ M+H ]+:m/z理論值為349.114 26，檢測值為349.113 94。

(4)(S)-N-(3-胺丙基)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酰胺(NI-Y-A，5)

將0.056 g 化合物3(0.15 mmol)溶于2.0 mL甲醇，緩慢滴加0.5 mL 1,3-丙二胺(6.0 mmol)，室溫下攪拌6 h。旋干溶劑、過柱分離，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(體積比為5∶1)。得最終產(chǎn)品0.045 g，產(chǎn)率為72.6%。

1H NMR δ(DMSO-d6):8.17(1H,d,CO—NH—CH),7.90(1H,t,CO—NH—CH2),7.33(1H,s,imi-H),7.08(1H,s,imi-H),6.92(2H,d,—C6H4—),6.61(2H,d,—C6H4—),4.51(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.33(1H,m,NH—CH—CO),3.05(2H,m,NH—CH2),2.72(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.67(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),2.58(2H,m,CH2—CH2—CH2),1.40(2H,m,CH2—CH2—CH2)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C18H25N6O5[ M+H ]+:m/z理論值為405.188 09，檢測值為405.187 81。

1.3 標(biāo)記物的制備及性質(zhì)測定

根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]，利用Iodogen作為氧化劑，從而分別得到[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A等3種碘標(biāo)記化合物。以[131I]NI-Y-M的制備為例，方法如下：

將100 μg化合物3(NI-Y-M)溶于0.4 mL 0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH=7.0)，然后轉(zhuǎn)入已涂好100 μg Iodogen的0.5 mL的離心管中，再加入2.96 MBq Na131I，漩渦振蕩5 min。靜置20 min后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移，終止反應(yīng)。

通過HPLC分析標(biāo)記物的放射化學(xué)純度。采用高效液相系統(tǒng)配置Packard 500TR系列的放射性檢測器，C-18反相柱(Agilent HC-C18.5 μm,4.6 mm×150 mm)，梯度洗脫，流速為1 mL/min。流動(dòng)相條件如下：溶劑A為95%水和5%甲醇，溶劑B為95%甲醇和5%水，溶劑A和溶劑B均含有0.1%的三氟乙酸(TFA)，淋洗梯度列入表1。

表1 流動(dòng)相淋洗條件

將標(biāo)記物的溶液室溫放置24 h后測定標(biāo)記率的變化。

取0.1 mL標(biāo)記物于離心管中，分別加入4.0 mL正辛醇，4.0 mL 0.025 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，漩渦振蕩2 min，離心5 min(3 000 r/min)，分別取出水相和有機(jī)相各0.1 mL檢測。根據(jù)有機(jī)相與水相的放射性活度比，求出相應(yīng)的油水分配比PO/W，重復(fù)3次取平均值。

1.4 電泳實(shí)驗(yàn)

以0.050 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液為電泳液，電泳載體為Whatman 3號濾紙條，長度20 cm，先用電泳液浸濕，再分別將3種標(biāo)記物點(diǎn)在紙條中間，在200 V電壓下電泳4 h。取出干燥后，將紙條剪成每段1 cm的小段，相同條件下檢測每段紙條的放射性活度。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

健康雄性昆明小白鼠，體重(20±2)g，向其左側(cè)腋部皮下移植約106個(gè)S180細(xì)胞。7～8 d后，腫瘤直徑約10～15 mm。實(shí)驗(yàn)前三天喂食1% KI水溶液進(jìn)行甲狀腺封閉，實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別取[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A標(biāo)記液0.1 mL(約111 kBq)，通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。在注射后1、2、4 h，從小鼠眼底取血后，斷頸處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行5只。剝離腫瘤、各臟器和組織，用水洗滌，拭干后稱重，然后測量其放射性計(jì)數(shù)。0.1 mL的注射液被作為標(biāo)準(zhǔn)也測量其放射性計(jì)數(shù)，用來計(jì)算各器官的放射性攝取(%ID/g)。最后結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

2 結(jié)果和討論

2.1 化合物合成

實(shí)驗(yàn)中合成的化合物均通過1H NMR、ESI-MS檢測。

在合成化合物2時(shí)，試劑丙烯酰氯是參照文獻(xiàn)[13]的方法合成，活性高、易潮解，同時(shí)，由于酪氨酸的酚羥基也具有一定的活性，所以實(shí)驗(yàn)必須控制丙烯酰氯的滴加速度，不能過快。即使這樣仍不能避免酚羥基副反應(yīng)的發(fā)生，因而副反應(yīng)的存在制約了目標(biāo)化合物產(chǎn)率的提高?；衔?(NI-Y-M)的合成反應(yīng)屬于Michael 加成，反應(yīng)條件比較苛刻，同時(shí)由于2-硝基咪唑溶解度的原因，最終所得產(chǎn)物NI-Y-M 產(chǎn)率較低?；衔?(NI-Y)的合成屬于經(jīng)典的酯類水解反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)方法簡單易行，溫和的水解條件既保證了目標(biāo)產(chǎn)物的生成，又避免了酰胺鍵的斷裂。對于化合物5(NI-Y-A)，最初采用羧酸和胺的直接縮合反應(yīng)，考慮到酪氨酸酚羥基的活性，選用溫和的縮合試劑苯并三氮唑-1-氧三(二甲胺基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)。TLC監(jiān)測顯示，縮合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，但是由于反應(yīng)體系生成的副產(chǎn)物影響NI-Y-A的分離提純，后來嘗試酯的氨解反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于本反應(yīng)體系，室溫條件下反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，反應(yīng)較快、轉(zhuǎn)化率高、分離方便。

2.2 標(biāo)記物性質(zhì)的測定

采用RP-HPLC法分析131I的標(biāo)記物，標(biāo)記結(jié)果示于圖2。由圖2可知：Na131I溶液以及Iodogen與Na131I 反應(yīng)產(chǎn)物的保留時(shí)間均為1.8 min；[131I]NI-Y-M的保留時(shí)間為11.6 min；[131I]NI-Y的保留時(shí)間為9.8 min；[131I]NI-Y-A的保留時(shí)間為7.6 min。3種標(biāo)記物的標(biāo)記率均大于95%，室溫下將標(biāo)記物在空氣中放置24 h后，其標(biāo)記率仍大于95%。因而實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)記物具有很好的穩(wěn)定性。

圖2 131I-(a)、[131I]NI-Y-M(b)、[131I]NI-Y(c)和[131I]NI-Y-A(d)的RP-HPLC檢測譜圖

電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3。由圖3可知：對于[131I]NI-Y-M 幾乎所有的放射性聚集在原點(diǎn)附近，而[131I]NI-Y、[131I]NI-Y-A分別不同程度的向正極和負(fù)極遷移。這說明在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)，標(biāo)記物[131I]NI-Y-M不帶電荷，[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A分別帶負(fù)電和正電。

油水分配比的實(shí)驗(yàn)顯示：[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A 的lgPO/W分別為1.46±0.03(n=3)、-1.97±0.04(n=3)和-1.31±0.03(n=3)，[131I]NI-Y-M具有高的脂溶性，[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A親水性較高。

2.3 生物分布結(jié)果

[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列入表2。由表2可知，3種化合物在心、肌肉、腦、脾、肺等器官的放射性攝取低，并且清除較快，而在腫瘤部位則呈現(xiàn)出快攝取慢清除的趨勢。因而在注射后隨著時(shí)間的延長，腫瘤與肌肉放射性攝取的比值能持續(xù)維持在相對較高的水平。以4 h的數(shù)據(jù)為例，[131I]NI-Y-M的腫瘤與肌肉放射性攝取的比值上升至3.33，[131I]NI-Y為2.80，[131I]NI-Y-A為5.00。為了避免小鼠甲狀腺對碘標(biāo)記化合物的特異性攝取，實(shí)驗(yàn)采用1% KI水溶液喂食小鼠，從甲狀腺的低攝取值可以確認(rèn)甲狀腺已經(jīng)被成功封閉。

從表2還可發(fā)現(xiàn)，雖然3種化合物腫瘤的放射性攝取相對較高，但是由于它們不同的帶電性質(zhì)，導(dǎo)致在某些器官組織的攝取、代謝、清除存在明顯的差異，腫瘤與這些器官組織的放射性比值差異較大。例如：4 h 時(shí)，[131I]NI-Y-M的腫瘤與血液放射性攝取的比值為0.48，[131I]NI-Y為0.68，[131I]NI-Y-A為1.43。具體而言，對于[131I]NI-Y-M，血液、肝臟、小腸等器官放射性攝取值高，這也可能與其高脂溶性有關(guān)；而對于[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A，腎的放射性攝取值明顯較高，這可能是由于它們的親水性好的緣故。

Kim等[16]發(fā)現(xiàn)，以DO3A、DO2A或NOTA為雙功能連接劑，以三苯基膦為靶向基團(tuán)的64Cu的標(biāo)記物電荷對其腫瘤特異性影響很大。帶一個(gè)正電荷的64Cu(DO2A-xy-TPP)+比帶2個(gè)正電荷、中性及帶負(fù)電荷的其余5個(gè)標(biāo)記物的肝攝取低，腫瘤/肝的攝取比高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他們的結(jié)論基本類似。

圖3 [131I]NI-Y-M(a)、[131I]NI-Y(b)和[131I]NI-Y-A(c)電泳實(shí)驗(yàn)的檢測譜圖

綜合以上的分析，可以確認(rèn)帶有不同電荷的化合物其在動(dòng)物體內(nèi)的分配、吸收攝取、代謝清除的情況存在不同。由于本實(shí)驗(yàn)僅選用一個(gè)母體分子(2-硝基咪唑的酪氨酸骨架)，樣本太少，目前還難以明確是否化合物電性的改變能夠有效改善腫瘤對乏氧顯像劑的攝取，但是對于本實(shí)驗(yàn)選定評價(jià)體系，從腫瘤與血液、腫瘤與肌肉放射性攝取的比值數(shù)據(jù)能夠確認(rèn)帶正電的標(biāo)記物[131I]NI-Y-A要優(yōu)于中性的標(biāo)記物[131I]NI-Y-M和呈現(xiàn)負(fù)電性的標(biāo)記物[131I]NI-Y。

表2 [131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A在荷瘤小鼠中的生物分布

3 結(jié) 論

合成了3種含有2-硝基咪唑的酪氨酸骨架結(jié)構(gòu)化合物NI-Y-M、NI-Y 和NI-Y-A，并采用Na131I，以Iodogen為氧化劑，完成了化合物的標(biāo)記。3種標(biāo)記物的標(biāo)記率均大于95%，室溫下放置24 h穩(wěn)定。電泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，同等條件下，標(biāo)記物[131I]NI-Y-M為電中性，[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A分別帶負(fù)電和正電。小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在一定程度上具有不同電荷的化合物在體內(nèi)的生物學(xué)行為存在不同。雖然所選評價(jià)體系的結(jié)果顯示，帶正電的標(biāo)記物[131I]NI-Y-A具有最優(yōu)的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉放射性攝取的比值，但是限于實(shí)驗(yàn)評價(jià)體系樣本太少，目前尚難以對電荷的影響得出明確的結(jié)論，仍需要進(jìn)一步的研究和探索。

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