123I的制備及其標(biāo)記新型小分子融合肽的初步研究

楊遠(yuǎn)友，劉 寧，范成中，廖家莉，許發(fā)倫，石福坤，蘭 棟，唐 軍

1.四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點實驗室，四川 成都 610064;2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041;3.四川大學(xué) 物理學(xué)院，四川 成都 610064

123I是加速器生產(chǎn)核素，其半衰期為13.2 h，通過電子俘獲發(fā)射159 keV的光子，比活度高(7.10×1016Bq/g)，對病人的輻射劑量低，在同樣活度下對甲狀腺的劑量只有131I的1/100左右，可在短期內(nèi)重復(fù)檢測，探測效率高，成像清晰，被認(rèn)為是最適合作體內(nèi)診斷的放射性核素之一[1-2]。

單克隆抗體介導(dǎo)的靶向顯像與靶向治療是對腫瘤以及血栓栓塞性疾病等診斷與治療的有效手段之一。由于完整單抗分子量大，穿透力差，在靶組織中濃集需較長時間且分布不均勻，清除慢；為得到穿透力強的小分子片段，采用DNA重組技術(shù)，將編碼特異抗體輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列，用特別設(shè)計的寡核苷酸連接，可得到2～35 kDa的肽段，重鏈可變區(qū)的羧基端通過一條12～20殘基的肽與輕鏈氨基端相連接，其特異性和親和力與親本抗體相同。小分子融合肽擬似物VHCDR1-VHFR2-VLCDR3為經(jīng)過DNA重組技術(shù)得到的分子量約為3 kDa的抗體片段[3]。近期進行了131I標(biāo)記VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的研究，其標(biāo)記物對腫瘤組織已顯示出良好的特異性和親和力[4]。在此基礎(chǔ)上，本實驗擬用核性質(zhì)優(yōu)于131I的123I標(biāo)記小分子融合肽擬似物VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，以期得到具有良好靶向性的放射性顯像藥物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3。

基于上述設(shè)想，本實驗首先進行了123I的生產(chǎn)，在此基礎(chǔ)上進行小分子融合肽擬似物的123I標(biāo)記，并對標(biāo)記物在正常小鼠的體內(nèi)分布進行初步研究。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

CS-30回旋加速器，美國TCC公司生產(chǎn)；溴代琥珀酰亞胺(NBS，純度大于98%)，美國Acros公司；硅膠(silica gel，0.125～0.178 mm)、TLC硅膠板(20 cm×20 cm)，美國Aldrich公司；凝膠Sephadex G10，瑞典Pharmacia公司；BS210S電子天平，感量0.001 g，德國Sartorius公司；甘氨酸(glysine)，美國Sigma公司；FH-603井型閃爍探頭、FH463A自動定標(biāo)器，北京核儀器廠；VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，小分子融合肽，相對分子質(zhì)量約為3 kDa，本課題組自制；石英蒸餾器，本實驗室設(shè)計加工；Sb2O3，純度99.99%，天津化學(xué)試劑一廠；KOH、檸檬酸，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；其它試劑為市售分析純；蒸餾水為三蒸水。

昆明系小鼠，(20±2)g，雌雄各半，購于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)動物實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1123I的制備123I的制備方法主要有兩大類：第一類是用帶電粒子核反應(yīng)先產(chǎn)生123Xe，然后由其衰變?yōu)?23I[5-6]；第二類是用帶電粒子轟擊碲靶或銻靶直接產(chǎn)生123I[7-11]?？紤]本實驗室條件(CS-30加速器)及研制成本，決定采用天然豐度的銻作為靶材料，利用121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)制備醫(yī)用123I。根據(jù)Sb(α,xn)反應(yīng)(表1)和激發(fā)曲線，122I半衰期較短，126I和125I的產(chǎn)額較低，主要副反應(yīng)為124I，選擇適當(dāng)能區(qū)以及選擇適當(dāng)靶厚，可以控制124I的產(chǎn)額[12-13]，得到核純度比較好的醫(yī)用123I。試驗中采用靶厚度為61～67 mg/cm2的薄靶，如靶厚大于144 mg/cm2，則有可能發(fā)生大量的(α,n)反應(yīng)，從而生產(chǎn)大量雜質(zhì)124I和126I。雖然這種方法會損失一定產(chǎn)額，但是可以生產(chǎn)出純度好的醫(yī)用123I。本實驗α粒子的能量控制在26.5 MeV左右。

表1 天然Sb靶制備123I的反應(yīng)及其副反應(yīng)[10]

1)Sb2O3電鍍液的配制

將10 g Sb2O3、35 g KOH以及182.5 g檸檬酸溶入500 mL水中，在加熱煮沸的條件下攪拌數(shù)分鐘，得到Sb2O3電鍍液。

2)Sb電鍍條件

將電鍍裝置電壓調(diào)至6 V、電流調(diào)至85 mA、陰極和陽極間距調(diào)至3 cm左右。在上述條件下電鍍14～15 h便可得到61～67 mg/cm2的均勻薄靶，沖洗晾干備用。

3)Sb靶的輻照

將制備好的銻靶在四川大學(xué)CS-30回旋加速器上，通過121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)，照射2～3 h，入射的α粒子束流強度在15 μA左右，能量為26.5 MeV左右，將束流以小角度入射到靶上，即采用所謂“傾斜靶”(如束流對靶子的入射角度為6度，其照射面積就增加了10倍，受照熱功率是垂直照射靶的1/10，而且散熱面積也增加了10倍)，并用水對靶進行冷卻。輻照結(jié)束后將靶子放置冷卻2 h左右，讓短壽命雜質(zhì)核素衰變。

4)輻照Sb靶的干蒸餾分離及Na123I的獲取

“冷卻”2 h后取出輻照靶片，小心放入石英蒸餾裝置中的石英舟里將石英舟加熱至600～750 ℃，用N2作為載氣，以15～30 cm3/min的流速通過靶片，用硅膠吸附蒸出的123I(硅膠柱用自來水冷卻)，再用活性碳和0.1 mol/L NaOH溶液吸附殘余的123I，尾氣最后排空。硅膠吸附柱用100～300 μL的0.1 mol/L NaOH溶液淋洗，洗脫液即為Na123I溶液。將Na123I溶液進行放射化學(xué)純度和γ能譜測定，以確定123I的放射化學(xué)純度和核純度。Na123I的放射化學(xué)純度測定采用2010版《藥典》方法[14]，以75%甲醇為展開劑，參照放射化學(xué)純度測定法(附錄ⅩⅢ一法)進行[15]。用于動物實驗時，用0.5 mol/L HCl調(diào)pH=7.0，并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.0)稀釋配成Na123I注射液。

1.2.2123I標(biāo)記小分子融合肽及其分離 在微型反應(yīng)管中加入100 μL(1.85×107Bq)Na123I、10 μL醋酸、10 μL 10.0 g/L溴代琥珀酰亞胺的生理鹽水溶液和10 μL 1.0 g/L VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的生理鹽水溶液，室溫下反應(yīng)10～30 min。然后加入50 μL 0.5 mol/L glysine終止反應(yīng)。用TLC測量標(biāo)記率和放化純度(TLC條件：流動相V(CHCl3)∶V(CH3OH)=4∶1)。另外，取部分標(biāo)記混合物用Sephadex G10柱(20 cm×10 mm)進行標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的分離，以0.1 mol/L pH=7.6的磷酸緩沖溶液作淋洗液，收集淋洗液，每管1 mL，測定每管的放射性，繪出淋洗曲線，用TLC測量標(biāo)記率和放化純度(TLC條件同前)。

1.2.3123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布 將40只小鼠(雌雄各半)隨機分為10組，經(jīng)腹腔注射0.1 mL(30 kBq)未分離標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3和分離后的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，注射后分別于1、3、6、12、24 h處死小鼠。取血、心臟、肝、脾、腎、肺、胃、小腸、肌肉、甲狀腺(含頸部)等組織器官，稱重并測其放射性計數(shù)，計算各組織的放射性攝取率。放射性攝取率用0.1 mL相應(yīng)標(biāo)記物的放射性計數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，以每克組織攝取放射性占總注射劑量的百分比%ID/g表示(甲狀腺的攝取率以%ID表示)。

2 結(jié)果和討論

表2 輻照銻靶參數(shù)及123I產(chǎn)額

2.1123I的制備

以天然銻作為輻照靶，利用121Sb(α,2n)123I核反應(yīng)制備123I，只要根據(jù)Sb(α,xn)反應(yīng)的激發(fā)曲線選擇適當(dāng)?shù)哪軈^(qū)以及適當(dāng)?shù)陌泻?，就可以限?24I、126I等核素的生成，得到純度較高的醫(yī)用123I。實驗中輻照靶參數(shù)及123I產(chǎn)額列于表2。靶的平均厚度為63.2 mg/cm2，最高64.3 mg/cm2，最低62.2 mg/cm2，控制α粒子能量為26.5 MeV、束流強度為15 μA的情況下，123I的平均產(chǎn)額為11.6 TBq/(A·h)。靶厚度對123I產(chǎn)額有一定影響，但在厚度為62.2～64.3 mg/cm2的情況下無顯著性影響。

經(jīng)測定，Na123I的Rf值在0.6～0.7左右，其放射化學(xué)純度均高于99.3%。通過γ能譜測定，主要能區(qū)有：159 keV，123I，約98.6%；603 keV，124I，約1.0%；668 keV，126I，約0.4%。這說明得到了核純度較高的123I。

2.2 小分子融合肽的123I標(biāo)記、分離及其體外穩(wěn)定性

由于識別EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)表面抗原gp350/220抗原決定簇的單克隆抗體擬似物：VHCDR1-VHFR2-VLCDR3及VHCDR1-VLCDR3-VHFR2(對照)兩種化合物中均含有多個酪氨酸基團，可用放射性核素123I直接標(biāo)記。標(biāo)記過程簡單易行，可在短時間完成(10 min左右)。123I直接標(biāo)記后其放化純度可達(dá)90%～95%(表3)，可不分離直接進行動物實驗。本實驗對標(biāo)記混合物還用Sephadex G10凝膠柱進行了分離，其淋洗曲線示于圖1。淋洗得到的第1個放射性峰為標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，經(jīng)TLC分析鑒定，123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的Rf在原點處，與VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的Rf=0一致，而游離123I的Rf=0.57。淋洗液的放化純度達(dá)96.6%，可直接用于體內(nèi)動物實驗。將未分離標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3和分離后的標(biāo)記物進行了放化純度、體外穩(wěn)定性的比較(表3)。從表3可以發(fā)現(xiàn)，通過Sephadex G10凝膠柱分離后的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3，其放化純度高于未分離的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3。此外，標(biāo)記物(包括分離和未分離的123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)在室溫下放置48 h后，其放化純度無明顯變化，表明標(biāo)記物在體外是穩(wěn)定的。

表3 123I標(biāo)記VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的放化純度變化

圖1 123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3經(jīng)Sephadex G10的淋洗曲線

2.3123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布

對分離后的123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布進行了初步探討，并與未分離123I標(biāo)記物進行了對比(表4)。表4結(jié)果表明：123I標(biāo)記的小分子融合肽在正常小鼠體內(nèi)代謝較快，6 h后在組織的放射性攝取已較低；從放射性在各組織的分布看，在胃中攝取較高，123I標(biāo)記物的代謝有可能是通過胃腸道進行的；123I標(biāo)記物在各個時間點在甲狀腺的放射性攝取較低(接近于肌肉組織)，說明標(biāo)記物在體內(nèi)不易發(fā)生脫碘反應(yīng)；除在胃中的1 h和3 h外，標(biāo)記物分離與未分離兩者在正常小鼠體內(nèi)的分布、代謝無明顯差異。

通過上述實驗表明，123I標(biāo)記物在體內(nèi)不易脫碘且具有較高的體外穩(wěn)定性，有必要對其進行更深入的研究。下一步將進行123I標(biāo)記的小分子融合肽對荷Raji細(xì)胞系裸鼠親腫瘤靶向分子顯像研究，探討荷瘤靶向分子顯像的可行性。

3 結(jié) 論

天然銻靶通過121Sb(α，2n)123I反應(yīng)，控制銻靶厚度在62.2～64.3 mg/cm2和α粒子能量在26.5 MeV的情況下，可以得到核純度高達(dá)98.6%的123I。在制備123I的基礎(chǔ)上進行了小分子融合肽擬似物的123I標(biāo)記，其標(biāo)記率可達(dá)90%以上。標(biāo)記物123I-VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的體內(nèi)外實驗表明，123I標(biāo)記物在體內(nèi)不易脫碘且具有較高的體外穩(wěn)定性，其研究結(jié)果為123I顯像藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

表4 分離與未分離的123I標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的分布實驗

[1]鄧新榮，劉飛，羅志福.123I放射性藥物簡介[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志，2007，27(3)：189-190.

[2]鄧新榮，羅志福.關(guān)于開展123I標(biāo)記藥物開發(fā)的調(diào)研[G]∥中國原子能科學(xué)研究院年報.北京:中國原子能科學(xué)研究院，2006:262-262.

[3]Qiu X Q,Wang H,Cai B,et al.Small Antibody Mimetics Comprising Two Complementaritydetermining Regions and a Framework Region for Tumor Targeting[J].Nature Biotech,2007,25: 921-929.

[4]Xie P,Fan C Z,Qiu X Q,et al.131I Labeled Small Antibody Mimetic VHCDR1-VHFR2-VLCDR3as a Novel Radiopharmaceutical for Targeting Burkitt’s Lymphoma in Nude Mice[J].Mol Imag Biol,in press.

[5]劉玉平，趙貴植，張寶琦，等.124Xe氣體靶制備高純度123I裝置中氣體處理系統(tǒng)的研制[G]∥中國原子能科學(xué)研究院年報.北京:中國原子能科學(xué)研究院，2007:299-300.

[6]羅志福，尹衛(wèi)，張寶琦，等.用124Xe 氣體靶制備高純度123I裝置的研制進展[G]∥中國原子能科學(xué)研究院年報.北京:中國原子能科學(xué)研究院，2007:300-301.

[7]Takacs S,Azzam A,Sonck M,et al.Excitation Function of122Te(d,n)123I Nuclear Reaction: Production of123I at a Low Energy Cyclotron[J].Appl Radiat Isot,1999,50(3): 535-540.

[8]鄭建，汪勇先.加速器制備123I[J].核技術(shù)，1996，19(4)：241-248.

[10]羅成，宋學(xué)光，畢素欣，等.123I的制備及其快速標(biāo)記[J].核化學(xué)與放射化學(xué)，1983，5(3)：224-232.

[11]Hassan K F,Qaim S M,Saleh Z A,et al.Alpha-Particle Induced Reactions onnatSb and121Sb With Particular Reference to the Production of the Medically Interesting Radionuclide124I[J].Appl Radiat Isot,2006,64(1): 101-109.

[14]碘[131I ]化鈉口服溶液[M]∥中國藥典二部.2010:1 072.

[15]附錄ⅩⅢ，放射性藥品檢定法，一法[M]∥中國藥典二部，2010:附錄123-124.