Luminol－K3［Fe(CN)6］流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系檢測(cè)頭孢吡肟

俞宏松，翟 倩，李曉璐，郭 晶，易 鋼

(重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

頭孢吡肟(Cefepime)為布邁－施貴寶公司(BMS)開發(fā)的新型第四代頭孢菌素，其抗菌譜廣，對(duì)多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌及革蘭陰性菌有抗菌活性，特別對(duì)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌有很強(qiáng)的抗菌活性。其抗菌作用機(jī)制是通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞的1個(gè)或多個(gè)青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)相結(jié)合，影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成與代謝，從而起到抗菌作用［1］。目前，頭孢吡肟的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法［2］、離子交換色譜法［3－4］、熒光法［5］、分光光度法［6］等，而用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定頭孢吡肟尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［7－9］。

流動(dòng)注射分析(FIA)是在熱力學(xué)非平衡條件下，通過(guò)載流驅(qū)動(dòng)重現(xiàn)技術(shù)來(lái)處理試樣或試劑區(qū)帶的動(dòng)態(tài)定量分析技術(shù)，具有分析速度快、準(zhǔn)確度和精密度好、自動(dòng)化程度高以及可與多種檢測(cè)手段相結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)［10－12］?；瘜W(xué)發(fā)光具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［13－15］。將流動(dòng)注射技術(shù)與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)聯(lián)用構(gòu)成的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法已成為近年來(lái)藥物分析的新手段之一［16－18］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI－B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安瑞邁電子有限公司);KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器公司);Milli-Q純水儀(密理博中國(guó)公司)。

頭孢吡肟標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(1.0×10－4g/mL):準(zhǔn)確稱取0.010 g頭孢吡肟標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究所)，用水溶解并定容至100 mL容量瓶(棕色)，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用時(shí)以水逐級(jí)稀釋至所需濃度;NaOH溶液(1 mol/L):稱取4 g氫氧化鈉用水溶解并定容至100 mL容量瓶(棕色)中備用，使用時(shí)以水逐級(jí)稀釋;魯米諾儲(chǔ)備溶液(2.0×10－3mol/L):準(zhǔn)確稱取0.035 4 g魯米諾，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)以0.1 mol/L NaOH溶液逐級(jí)稀釋;K3［Fe(CN)6］儲(chǔ)備液(2.0×10－3mol/L):準(zhǔn)確稱量0.065 9 g K3［Fe(CN)6］，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)以水逐級(jí)稀釋。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水(Milli-Q，≥18 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析裝置如圖1所示，各種實(shí)驗(yàn)溶液被泵入，在六通閥充分混合后發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生的光信號(hào)經(jīng)光電倍增管檢測(cè)。當(dāng)注入水時(shí)檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)為空白信號(hào)(I0);當(dāng)注入一定濃度的頭孢吡肟時(shí)檢測(cè)到的增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)為Ia，用相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI=Ia－I0進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在堿性介質(zhì)中，頭孢吡肟對(duì)Luminol－K3［Fe(CN)6］體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有顯著增強(qiáng)作用(圖2)，據(jù)此建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定頭孢吡肟的新方法，并對(duì)針劑中頭孢吡肟含量進(jìn)行了測(cè)定。

2.1 反應(yīng)物混合順序的影響

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流路圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence(CL)analysis system

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)物混合順序?qū)瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有較大影響。分別按照以下混合順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn):①(頭孢吡肟 +魯米諾)+(K3［Fe(CN)6］+氫氧化鈉);②(頭孢吡肟+氫氧化鈉)+(魯米諾+K3［Fe(CN)6］);③(頭孢吡肟 +K3［Fe(CN)6］)+(氫氧化鈉+魯米諾)。結(jié)果表明，進(jìn)樣方式①所得ΔI最大且穩(wěn)定，因此選擇此種方式進(jìn)樣。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 堿性介質(zhì)的選擇 本實(shí)驗(yàn)發(fā)光效應(yīng)需在堿性介質(zhì)中進(jìn)行，因此堿性介質(zhì)種類的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)有較大影響。分別在同濃度的NaOH，Na2CO3，NaHCO33種堿性介質(zhì)中測(cè)定頭孢吡肟對(duì)Luminol－K3［Fe(CN)6］體系化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)能力。結(jié)果表明，在NaOH溶液中，頭孢吡肟對(duì)發(fā)光體系的增強(qiáng)能力最強(qiáng)。因此選用NaOH為實(shí)驗(yàn)的堿性介質(zhì)。

2.2.2 NaOH濃度的影響 在0.06～0.16 mol/L范圍內(nèi)考察了NaOH濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。如圖3A所示，NaOH溶液濃度為0.12 mol/L時(shí)ΔI較大，之后隨著NaOH濃度的增加其發(fā)光效應(yīng)逐漸趨于穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選擇NaOH的濃度為0.12 mol/L。

圖2 化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)曲線圖Fig.2 Enhanced curve of the chemiluminescence system

圖3 各化合物濃度對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of compound concentrations on CL intensities of the system

2.2.3 魯米諾濃度的影響 魯米諾是本實(shí)驗(yàn)體系的發(fā)光劑，其濃度會(huì)影響體系的發(fā)光強(qiáng)度、檢測(cè)靈敏度及線性范圍。在固定其他條件不變的情況下，考察了魯米諾濃度在8.0×10－6～2.0×10－5mol/L范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響(圖3B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)魯米諾濃度為1.2×10－5mol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)體系的發(fā)光效應(yīng)較強(qiáng)且穩(wěn)定;隨著魯米諾濃度的繼續(xù)增加，發(fā)光強(qiáng)度的變化趨于穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選用魯米諾濃度為1.2×10－5mol/L。

2.2.4 K3［Fe(CN)6］濃度的影響 K3［Fe(CN)6］是本實(shí)驗(yàn)體系的氧化劑，其濃度同樣影響體系的發(fā)光強(qiáng)度及檢測(cè)靈敏度。固定其他實(shí)驗(yàn)條件不變，考察了K3［Fe(CN)6］濃度在8.0×10－6～3.2×10－5mol/L范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響(如圖3C)。結(jié)果顯示，當(dāng)K3［Fe(CN)6］濃度為1.2×10－5mol/L時(shí)ΔI較大;隨著K3［Fe(CN)6］濃度的繼續(xù)增加，體系的發(fā)光強(qiáng)度變化逐漸趨于穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選用K3［Fe(CN)6］的最佳濃度為1.2 ×10－5mol/L。

2.3 儀器參數(shù)的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，采樣時(shí)間、蠕動(dòng)泵的泵速、光電倍增管負(fù)高壓值影響發(fā)光體系的穩(wěn)定性、信噪比以及化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，儀器參數(shù)設(shè)定如下:采樣時(shí)間為5 s，蠕動(dòng)泵的泵速為30 r/min，光電倍增管負(fù)高壓為700 V。

2.4 線性范圍與檢出限

在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，頭孢吡肟在3.0×10－6～4.0×10－5g/mL濃度范圍內(nèi)與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI=434.58+76.26lgρ，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。對(duì)2.0×10－5g/mL的頭孢吡肟標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定11次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%。根據(jù)IUPAC建議，以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算出方法的檢出限為2.8×10－6g/mL。

2.5 干擾試驗(yàn)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了頭孢吡肟針劑中主要添加劑(L-精氨酸)和實(shí)驗(yàn)中可能的干擾物對(duì)頭孢吡肟含量測(cè)定的干擾。以相對(duì)誤差小于5%為允許量，對(duì)1.0×10－5g/mL頭孢吡肟進(jìn)行多種物質(zhì)的干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，100倍的Na+、K+、Cl－、葡萄糖，50倍的PO3－4、Zn2+、SO2－4，20倍的L-精氨酸、淀粉、糊精、乳糖，以及等倍濃度的Ca2+與Mg2+均不干擾測(cè)定。由于頭孢吡肟針劑中上述干擾物質(zhì)的實(shí)際含量均低于允許量，因此無(wú)須分離或其他處理，可直接測(cè)定。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取頭孢吡肟針劑(悅康集團(tuán))0.010 g，加水溶解并定容至100 mL，使用時(shí)以水稀釋其濃度至工作曲線范圍。頭孢吡肟針劑溶液稀釋20倍后，頭孢吡肟的標(biāo)記濃度為5.0×10－6g/mL。采用本方法對(duì)針劑中的頭孢吡肟含量平行測(cè)定9次，得平均值為5.03×10－6g/mL，RSD為1.3%。分別按照低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的回收率分別為97%，102.3%，98.5%，RSD分別為0.6%，1.1%，1.9%，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test

3 結(jié)論

本文基于頭孢吡肟在堿性介質(zhì)中對(duì)Luminol－K3［Fe(CN)6］化學(xué)發(fā)光體系具有明顯的增強(qiáng)作用，建立了測(cè)定頭孢吡肟的新方法。該方法靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好，用于頭孢吡肟針劑的檢測(cè)，結(jié)果滿意。該方法有望成為臨床檢測(cè)頭孢吡肟濃度的方法之一。

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