液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定葡萄酒中6種吡唑類殺菌劑

陳祥準，夏碧琪，黃芙珍，程 潔，沈 燕，韓 超*

(1．溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州 325027;2．溫州大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

殺菌劑是用于防治由各種病原微生物引起的植物病害的一類低毒農(nóng)藥。吡唑類化合物具有高效、低毒以及吡唑環(huán)上取代基可多方位變換等優(yōu)勢和多種生物活性，是新型殺菌劑開發(fā)的熱點之一［1］。近年來，多種吡唑類殺菌劑被越來越廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病害控制，如谷物、蔬菜和水果等。許多國家和組織對其在植物源性食品中的限量已出臺了相關(guān)規(guī)定，如歐盟規(guī)定葡萄酒中氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、聯(lián)苯吡菌胺的最高殘留量(MRLs)為0.01 mg·kg－1［2］。因此，建立準確、可靠的測定葡萄酒中吡唑類殺菌劑殘留量的方法非常重要。

目前，關(guān)于食品和環(huán)境中殺菌劑檢測的研究［3－16］已有報道，但對葡萄酒中吡唑類殺菌劑的檢測方法研究較少，且未見同時測定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺殘留量的報道。本文結(jié)合固相萃取和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析，建立了同時測定葡萄酒中上述6種吡唑類殺菌劑的分析方法，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、結(jié)果準確等優(yōu)點，可用于實際樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);Elma P300 H超聲波清洗器(德國Elma公司)，甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司);甲酸(純度≥99%)、乙酸(純度100%)、甲酸銨(純度≥99%)、乙酸銨(純度≥97%)(美國Alfa Aesar公司);MCX SPE強陽離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);MAX SPE強陰離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);HLB SPE強陽離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);ENVI C18交換柱固相萃取柱(Superclean，60 mg/3 mL);其它試劑均為分析純。實驗用葡萄酒為附近超市或企業(yè)送檢樣品。呋吡菌胺(純度≥99.9%)、吡咪唑(純度≥99.0%)、氟唑菌酰胺(純度≥99.7%)、聯(lián)苯吡菌胺(純度≥98.5%)均購自Dr．Ehrenstorfer GmbH，戊苯吡菌胺(純度≥98.4%)、吡唑萘菌胺(純度≥99.7%)購自Sigma－Aldrich公司;上述6種吡唑類殺菌劑標準品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為500 mg·L－1的儲備液;使用時，以甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成1 000 μg·L－1的混合標準工作溶液。基質(zhì)校準工作溶液制備:分別稱取5.0 g空白葡萄酒樣品5份，按照“1.3”方法進行樣品處理，氮吹至約0.5 mL，依次加入5，10，25，50，250 μL的混合標準工作溶液，再用甲醇定容至5 mL，即得濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，50.0 μg·L－1的基質(zhì)校準工作溶液。

1.2 色譜－質(zhì)譜條件

1.2.1 液相色譜條件 Agilent ZOBRAX C18(2.1 mm×150 mm，5 μm);流動相:A為0.1%乙酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～4 min，50%～90%B，保持11 min;流速:250 μL·min－1;進樣量為10 μL，柱溫30℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源:負離子掃描;離子源溫度500℃;電噴霧電壓5 000 V;霧化氣(GS1)壓力344.5 kPa;輔助氣流速(GS2)275.6 kPa;氣簾氣壓力68.9 kPa;碰撞氣(CAD)壓力137.8 kPa。監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

1.3 樣品處理與凈化

1.3.1 提 取 稱取葡萄酒樣品5.0 g，加入3 mL超純水混勻得到待檢液。

1.3.2 凈 化 HLB SPE柱依次用甲醇和水活化，取全部待檢液至SPE柱，待樣品溶液全部流出后，再依次用6 mL水和6 mL甲醇－水混合溶液(2∶3)淋洗，真空抽干，用6 mL甲醇洗脫，洗脫液40℃氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后，供LC－MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化條件的優(yōu)化

葡萄酒的成分復(fù)雜，含有多種花色素和酚類等干擾物質(zhì)［17－18］，本研究將樣品直接加水稀釋，考慮到葡萄酒樣品中的大量基質(zhì)雜質(zhì)可能會影響待測物的定性和定量分析結(jié)果，故需要對提取液進行凈化處理。實驗采用SPE固相萃取柱凈化提取液。

2.1.1 SPE柱的選擇 分別對葡萄酒加標濃度為1.0 μg·kg－1的6種吡唑類殺菌劑進行回收率實驗，考察了不同SPE柱(Waters Oasis HLB、Waters Oasis MCX、Waters Oasis MAX和Superclean ENVI C18)的凈化回收率。重復(fù)測定3次，計算方法的平均回收率。結(jié)果表明，MCX、MAX和C18柱的回收率為65.6%～81.5%，而HLB柱的凈化效果相對較好，回收率為72.8%～92.6%，可滿足檢測要求。因此實驗采用Waters Oasis HLB柱進行凈化處理。

2.1.2 淋洗液的選擇 考察了甲醇－水淋洗液配比(20%，30%，40%，50%)對萃取回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40%甲醇水溶液凈化的回收率(82.4%～93.5%)與20%(回收率為81.4%～92.1%)以及30%(回收率為82.0%～92.4%)甲醇水溶液凈化的回收率相差不大，且不會將6種吡唑類殺菌劑洗脫下來。而50%甲醇水溶液會將部分吡唑類殺菌劑淋洗下來(回收率為38.5%～57.1%)，對回收率有較大影響。考慮到甲醇含量高時，可以淋洗掉更多的雜質(zhì)，減少對儀器的污染，因此實驗采用40%甲醇水溶液為淋洗液。隨后采用6 mL純甲醇作為洗脫液洗脫待測化合物。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將200 ng·mL－1的6種吡唑類殺菌劑標準溶液在ESI源正離子和負離子模式下進行全掃描，以選擇適當?shù)亩ㄐ?、定量離子和電離方式。結(jié)果表明:在ESI源的負離子模式下，6種殺菌劑均呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，準分子離子［M－H］－是響應(yīng)強度最高的離子。確定母離子后，在MRM模式下通過優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1。

表1 化合物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized MRM parameters for the determination of compounds

2.3 色譜條件的優(yōu)化

考察了不同色譜柱(ZORBAX Eclipse Plus C18，Waters X BridgeTMC18，Waters XselectTMHSS T3)對6種吡唑類殺菌劑分離效果和靈敏度的影響。結(jié)果表明，使用 Agilent ZOBRAX C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色譜柱時分離效果最佳。分別考察了以甲醇－水和乙腈－水為流動相，以及在流動相中分別添加0.05%和0.1%的甲酸、乙酸，10 mmol/L的甲酸銨、乙酸銨等物質(zhì)時對目標物色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機相為乙腈時的分離效果優(yōu)于甲醇;在加入甲酸溶液后，負離子的形成受到抑制，而0.1%乙酸水溶液－乙腈體系的靈敏度優(yōu)于甲酸銨－乙腈和乙酸銨－乙腈體系，故實驗選擇0.1%乙酸水溶液－乙腈為流動相，以獲得較好的色譜峰形。其總離子流圖見圖1A。

2.4 方法評價

圖1 6種吡唑類殺菌劑標準溶液(1.0 ng·mL－1，A)及空白葡萄酒中添加6種殺菌劑(0.4 μg·kg－1，B)的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of six pyrazole fungicides(1.0 ng·mL－1，A)and a grape wine sample spiked with six pyrazole fungicides(0.4 μg·kg－1，B)

本方法采用基質(zhì)匹配標準溶液進行校正補償，以減少基質(zhì)效應(yīng)對6種殺菌劑檢測結(jié)果的干擾。在優(yōu)化條件下，考察了6種待測物的線性范圍，結(jié)果顯示，6種待測物的質(zhì)量濃度(X，μg·L－1)均在 1.0 ～50.0 μg·L－1范圍內(nèi)與其峰面積(Y，Counts)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.999 3。以10倍信噪比(S/N)計算方法定量下限(LOQ)為 0.1 ～0.4 μg·kg－1(表 2)。與目前歐盟對葡萄酒中3種殺菌劑的最大殘留限量(0.01 mg·kg－1)［2］要求相比，本方法完全滿足這6種殺菌劑的檢測要求。

在低、中、高3個加標水平下對同一空白葡萄酒樣品進行3次平行實驗，回收率與相對標準偏差(RSD)列于表2。由表2可知，各化合物的平均回收率為72.8%～92.6%，RSD不大于6.7%，本方法的準確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。圖1B為空白葡萄酒樣品中添加6種殺菌劑(0.4 μg·kg－1)后的總離子流色譜圖。

表2 6種吡唑類殺菌劑的線性關(guān)系、定量下限、回收率及相對標準偏差(n=3)Table 2 Regression relationships，limits of quantitation(LOQ)，recoveries and RSDs of six pyrazole fungicides(n=3)

2.5 實際樣品的測定

采用本文建立的方法，對實驗室受理的50種進口葡萄酒進行6種吡唑類殺菌劑殘留檢測，結(jié)果均未檢出上述6種殺菌劑。

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺的分析方法，該方法前處理簡單，靈敏度高，定性、定量準確，滿足國際上對葡萄酒中吡唑類殺菌劑MRLs的要求，可用于葡萄酒中這6種殺菌劑的日常測定和確證工作。

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