木瓜提取液對大鼠骨組織中ColⅠ和Cath L表達的影響

李旭斌，陳秀峰，王桂敏，艾 浩

（1遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生院，遼寧 錦州 121001；2航天中心醫(yī)院 普外科，北京 100049；3遼寧醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，遼寧 錦州 121001）

木瓜屬薔薇科木瓜屬落葉灌木植物，其用途廣泛，可食用、藥用.現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)木瓜有殺蟲抗炎、抗結(jié)核、通乳抗癌、解痙止痛、促進損傷肝細(xì)胞修復(fù)、抑制腎移植后的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞抗體、降低血糖、促進新陳代謝、美容抗衰老、抗骨質(zhì)疏松等多種作用.骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，進而骨骼脆性增加，容易發(fā)生骨折的系統(tǒng)性疾病［1］.隨著世界人口老齡化的加快，OP在全世界發(fā)病率逐年上升，絕經(jīng)后婦女發(fā)病率更高，其特征是骨量減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)改變，骨折的危險性增大.臨床治療藥物主要包括:激素調(diào)節(jié)藥物（雌激素等）、促進骨形成藥物（甲狀旁腺激素）、促進骨礦化藥物（維生素D、鈣劑）等.這些藥物對治療OP有效，但伴隨有嚴(yán)重副作用，如激素長期治療出現(xiàn)的血凝狀態(tài)、高血壓、水腫［2］、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等［3］.本文通過建立去勢后大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察木瓜提取液對去卵巢大鼠破骨細(xì)胞組織蛋白酶L（Cath L）表達以及成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原（ColⅠ）代謝的影響，為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松尋求理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

木瓜由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥局提供，PINP、ICTP檢測試劑盒均購自美國sigma公司，ColⅠ、Cath L試劑購于上?？岛樯锟萍加邢薰?，10%水合氯醛溶液、4%多聚甲醛溶液購自遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，尼爾雌醇購自北京益民藥業(yè)（批號0904100）.3個月齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～220g，由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心提供（動物合格證號:LJ08023）.

1.2 藥物制作

將木瓜50g用15倍量的水浸泡30min后，沸水煎煮20min，藥液放入濃縮缸內(nèi)濃縮.木瓜低劑量組按人與大鼠體表面積1∶0.0179比例換算大鼠每天用藥量，相當(dāng)于15.2g/kg含生藥量；木瓜高劑量組含生藥量是低劑量組的4倍，相當(dāng)于60.8g/kg的含生藥量.以上藥物給藥容積為1.79mL，灌胃，每日一次.雌激素組給予1.5mg/kg的尼爾雌醇，用生理鹽水稀釋成等體積混懸液.

1.3 動物分組及模型制做

將50只健康成年SD大鼠，按完全隨機數(shù)字法分為5組，每組10只:假手術(shù)組、模型組、雌激素組、木瓜低劑量組、木瓜高劑量組.將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/100g體重），以俯臥姿勢固定在手術(shù)架上，在季肋、腋中線和脊柱外側(cè)入路暴露雙側(cè)卵巢，除假手術(shù)組僅暴露外，其余各組均切除雙側(cè)卵巢.術(shù)后肌注青霉素1萬u/只，連用3 d.術(shù)后第2天開始行陰道細(xì)胞涂片檢查，每天一次，連續(xù)5d，如果陰道上皮角化細(xì)胞無周期性變化，證明卵巢去除成功.

1.4 給藥方式

按大鼠體重計算每日用藥量；假手術(shù)組和模型組每日給予1.79mL等量生理鹽水；雌激素組灌胃尼爾雌醇1.5mg/kg，1次/3d，其余2d灌胃等量生理鹽水；木瓜低劑量組每日灌胃1.79mL木瓜提取液（含3.04g生藥），木瓜高劑量組每日灌胃1.79mL木瓜提取液（含9.12g生藥），每天一次，連續(xù)12周.

1.5 標(biāo)本檢測及方法

1.5.1 骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定 右側(cè)股骨用4%多聚甲醛溶液固定24h后用10%EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，取股骨髁部相同部位制成5μm厚的組織切片，HE染色，光鏡下行病理形態(tài)檢查.

1.5.2 骨生化指標(biāo)的測定 PINP和ICTP均用試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法測定.

1.5.3 分子生物學(xué)指標(biāo)的測定 Cath L和ColⅠ蛋白采用SABC免疫組織化學(xué)染色法測定.

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)用（＋s）表示.多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05差別有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 對大鼠PINP，ICTP表達的影響

由表1可見，與模型組比較:木瓜高劑量組和雌激素組血清PINP含量顯著升高（P＜0.05）；木瓜高劑量組和雌激素組血清ICTP含量顯著下降（P＜0.05）；木瓜高劑量組與雌激素組比較沒有顯著差異（P＞0.05）.而木瓜低劑量組與模型組比較顯著下降（P＜0.05）.

表1 各組大鼠PINP，ICTP表達（x±s，n＝10）Tab.1 PINP and ICTP expression in the difference groups（x±s，n＝8）

2.2 木瓜對ColⅠ蛋白表達的影響

由表2可見，ColⅠ蛋白主要在成骨細(xì)胞胞漿及細(xì)胞間質(zhì)表達，染色為棕黃色或深棕黃色纖維狀或顆粒狀提示陽性.在骨細(xì)胞胞漿中亦有少量表達.光鏡下觀察各組照片可以發(fā)現(xiàn)，木瓜高劑量組、木瓜低劑量組、雌激素組和假手術(shù)組蛋白陽性.與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)骨及骨小梁中染色較淺.與模型組比較，木瓜高劑量組、木瓜低劑量組、雌激素組的灰度增加.

2.3 木瓜對Cath L蛋白表達的影響

由表2可見，Cath L蛋白主要在骨小梁周圍的破骨細(xì)胞胞漿中表達，陽性染色為棕黃色，成骨細(xì)胞周圍亦可見到少量陽性顆粒.光鏡下觀察各組照片可見，于假手術(shù)組比較，模型組Cath L蛋白的表達明顯增多，木瓜組和雌激素組顯著減少.

表2 各組免疫組化染色的平均IOD值（×103）±＋s，n＝10）Tab.2 The average IOD values of immunohistochenical stains in the difference groups（×103）±＋s，n＝10）

表2 各組免疫組化染色的平均IOD值（×103）±＋s，n＝10）Tab.2 The average IOD values of immunohistochenical stains in the difference groups（×103）±＋s，n＝10）

注:與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與假手術(shù)組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01.

組別 ColⅠ18.9±3.6模型組 16.8±4.7★★ 78.9±5.1★★雌激素組 24.7±3.8▲▲ 23.7±3.2▲▲木瓜低劑量組 21.4±4.1▲ 21.5±3.3木瓜高劑量組 25.6±3.0▲▲ 22.3±3.7 Cath L假手術(shù)組 26.5±3.1※▲

2.4 病理切片特征

右側(cè)股骨用4%多聚甲醛溶液固定24h后用10%EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，取股骨髁部相同部位制成5μm厚的組織切片，HE染色，在光鏡下觀察各組切片組織病理學(xué)的變化.如圖1所示:假手術(shù)組可見骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨小梁致密粗壯，數(shù)目多，形態(tài)規(guī)則，間隙適中，排列齊整；模型組，骨小梁稀疏，骨小梁間有斷裂并且分離，間隙增大，排列紊亂，骨板層結(jié)構(gòu)疏松，骨質(zhì)疏松特征明顯；雌激素組，骨小梁粗壯，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，骨小梁排列致密，且骨小梁數(shù)目明盟多于模型組；木瓜提取液高劑量組可骨小梁致密豐實，間距較窄，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，寬度和間隙與假手術(shù)組和雌激素組接近.

圖1 二仙湯對各組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The influence of Erxian decoction on bone structure

3 討論

成骨細(xì)胞增殖階段基因表達的ColⅠ是人體最豐富的膠原類型，約占骨基質(zhì)的90%，它是構(gòu)成骨的重要成分［4－5］.當(dāng)纖維合成時，在特定蛋白的作用下使ColⅠ水解形成PINP，并釋放入血，因此，血中PINP水平反映了膠原合成速率和成骨細(xì)胞的活性［6－7］.ICIP是一種成熟的也是唯一的交聯(lián)物，是由ColⅠ降解時釋放出的［8－9］，它以完整的免疫原性蛋白形式進入血液中，其與ColⅠ降解的比例為1∶1.因此，血清中ICTP是特異性很高的反映骨吸收的敏感指標(biāo).所以，聯(lián)合檢測血清中PINP和ICTP的水平直接反映了骨Ⅰ型膠原合成和降解狀態(tài)［10］.本實驗中，與模型組比較:木瓜組血清中的PINP水平顯著升高（P＜0.05），木瓜高劑量組較低劑量組更為顯著；而對于ICTP，木瓜組血清中的含量顯著降低（P＜0.05）.由此可見，木瓜可以促進骨形成，同時抑制骨吸收，進而說明對去卵巢大鼠所致骨質(zhì)疏松能起到重要的防治作用.

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是老年婦女常患的一種代謝性骨病，患病率高［11］.雌激素水平的明顯下降是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要原因［12］.由于雌激素水平下降，減弱了對破骨細(xì)胞的抑制作用，破骨細(xì)胞破壞了骨小梁骨板層，導(dǎo)致骨小梁形成減少，骨小梁變窄，排列紊亂，從而影響骨形成和骨吸收的偶聯(lián)，使成骨細(xì)胞凋亡增加［6］.

對骨質(zhì)疏松癥分子水平上的研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞溶酶體向骨小腔分泌組織Cath L，進而造成以ColⅠ為主要成分的骨支持蛋白分解亢進，成為導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥形成的重要因素之一，是骨吸收過程中的一個關(guān)鍵酶［13－14］.在本實驗中，模型組的 Cath L活性明顯提高，木瓜組及雌激素組Cath L活性明顯降低，其中木瓜高劑量組與雌激素組無明顯差異.

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，木瓜提取液通過降低破骨細(xì)胞Cath L的表達從而起到抑制去卵巢大鼠骨組織中成骨細(xì)胞ColⅠ蛋白的降解作用，進而增加骨小梁的數(shù)量，改善骨小梁的結(jié)構(gòu)，降低骨的轉(zhuǎn)換率，從而達到對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松預(yù)防的目的.本研究旨在為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，降低骨質(zhì)疏松對機體的影響，從而為骨質(zhì)疏松的防治提供新的思路和途徑.

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