人Notch1 受體胞內(nèi)段重組腺病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

胡彥華，吳德全，姜明山，金光鑫，張雪松，胡彥建，李紅影

1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科，黑龍江 哈爾濱150086； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科； 4. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康和生命［1］。我國肝癌高發(fā)，占全球所有肝癌病例的一半以上。隨著近年來治療方法的不斷改進，特別是肝移植在臨床上的應(yīng)用，肝癌患者的預(yù)后已經(jīng)得到明顯的改善。但是，由于肝癌的高侵襲和高轉(zhuǎn)移能力使得患者還是難以逃離復(fù)發(fā)的命運。因此，深入研究肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找新的治療靶點，將對現(xiàn)代肝癌綜合治療體系做到必要、有益的補充，對肝癌患者臨床結(jié)局具有重要意義。

Notch 信號是一條進化中高度保守的細胞通路，研究表明Notch 信號與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)［2-3］。本研究通過構(gòu)建含有Notch 信號的Notch1 受體胞內(nèi)段(notch intracellular domain，NICD)基因的重組腺病毒，并轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2，使HepG2 模擬過度表達激活形式的Notch 信號，為Notch 信號過度表達對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性內(nèi)切酶、DNA 連接溶液、標準分子量DNA Marker 均購自Takara 公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒為上海華舜公司產(chǎn)品;DMEM、優(yōu)等胎牛血清(FBS)、細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 均購自Invitrogen 公司;含有Notch1受體胞內(nèi)段基因的pCDNA3-ICN#4 質(zhì)粒由北京軍事科學(xué)院惠贈;pDC316-CMV-EGFP 購自北京本元正陽公司。

1. 2 重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-CMVNotch1-Myc 的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)pCDNA3-ICN#4 提供的目的基因測序結(jié)果，于目的基因Notch1 受體胞內(nèi)段(NICD)的上游引入NotⅠ酶切位點(TAAACTATG CGGCCGC)，下游引入“Myc 標簽(CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCG)”+TAA 終止密碼子(TTA)+Hind Ⅲ酶切位點(TAAACTATAAGCTT)，設(shè)計引物序列如下:Notch1-NoⅠt-F:5＇-TAAACTATGCGGCCGC ATGTTCCCTGAGGGCTTCAAAG-3＇;Notch1-Myc-Hind Ⅲ-R:5＇-TAAACTATAAGCTT TTACAGATCCTCTTCTGA GATGAGTTTTTGTTCGGTTTTGTGGCTGCACCTG-3＇。應(yīng)用此引物對pCDNA3-ICN#4 質(zhì)粒進行不對稱RTPCR，退火溫度72 ℃，RT-PCR 產(chǎn)物跑電泳，切膠回收，用NotⅠ和Hind Ⅲ雙切產(chǎn)物，產(chǎn)物跑電泳，切膠回收1 800 bp 左右的目的片段。NotⅠ和HindⅢ雙切中間載體pDC316-CMV-EGFP，回收5. 3 kb 左右的大片段。將上述兩回收片段連接、轉(zhuǎn)化，得到pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc 質(zhì)粒。進行RT-PCR 酶切鑒定。

1.3 重組腺病毒的制備、鑒定及滴度測定方法 采用AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)，將pDC316-CMV-EGFP-CMVNotch1-myc 質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1，3Cre 用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體進行共轉(zhuǎn)染293 細胞。當(dāng)細胞變大、變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑，細胞大部分病變從底部脫落時，進行回收病毒。將細胞培養(yǎng)瓶先后置于-70 ℃冰箱和37 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次，使病毒從病變細胞中充分釋放。將凍融液3 000 r/min 離心5 min，收集含病毒的上清液，棄沉淀，該上清即為第一代毒種(P1)，作為隨后大量病毒擴增的毒種。毒種P1 感染293 細胞兩次，擴增病毒，經(jīng)0. 22 μm 濾器過濾，分裝后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，完成重組腺病毒的制備，該病毒命名為Ad-EGFP-NICDMyc。以病毒為模板，RT-PCR 鑒定重組腺病毒的NICD 及EGFP 基因。測定病毒滴度，將病毒液以不同稀釋度感染接種于96 孔板的293 細胞，按Reed ＆Muench 法計算病毒滴度。

1.4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2 培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2，6 孔板中每孔接種4 ×105個人肝癌細胞HepG2，孵育24 h 后細胞生長至60% ～70%融合度即進行轉(zhuǎn)染。重組腺病毒在無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2 2 h，加入10%牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d 后，熒光顯微鏡下觀察EGFP 的表達，采用細胞免疫化學(xué)的方法染色Myc 標簽，鑒定NICD表達。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 NotⅠ和HindⅢ酶切pCDNA3-ICN#4 質(zhì)粒的不對稱RT-PCR 產(chǎn)物，得到小片段(1 800 bp);Not Ⅰ和Hind Ⅲ酶切載體pDC316-CMV-EGFP，得到大片段(5 300 bp)。大、小片段連接后構(gòu)建新的質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-CMVNotch1-Myc(見圖1)，該質(zhì)粒雙啟動子，帶有Myc 標簽基因，氨芐青霉素抗性。以新質(zhì)粒為模板，以Notch1-NotⅠ-F 和Notch1-Myc-HindⅢ-R 為引物，RT-PCR 擴增編碼NICD 的DNA 片段，進行瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約1 800 bp 的片段(見圖2)。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和HindⅢ酶切后應(yīng)出現(xiàn)兩條帶:一條帶近5 300 bp;另一條帶為1 800 bp(目的片段);該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確(見圖3)。重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFPCMV-Notch1-Myc 成功構(gòu)建。

圖1 pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc 質(zhì)粒圖譜Fig 1 Construction of pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc

2.2 重組腺病毒的鑒定及滴度測定結(jié)果 重組載體轉(zhuǎn)染293 細胞2 d 后，在熒光顯微鏡下觀察，絕大部分細胞有EGFP 表達，5 ～7 d 感染細胞開始出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)，表現(xiàn)為細胞變圓、脫壁，并伴有噬斑出現(xiàn)，隨后回收Ad-EGFP-NICD-Myc 病毒。重組腺病毒的鑒定，提取Ad-EGFP-NICD-Myc 病毒基因組DNA，并以此為模版，以Notch1-NotⅠ-F 和Notch1-Myc-HindⅢ-R 為引物擴增編碼NICD 的DNA 片段，以EGFP-F 5＇-TGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3＇和EGFP-R 5＇-TGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGC-3＇為引物擴增編碼EGFP 的DNA 片段，進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果能夠特異地擴增出1 800 bp 左右大小的目的基因條帶，同時也能擴增出555 bp 大小的EGFP 基因條帶(見圖4)，證實該重組腺病毒攜帶NICD 及EGFP 基因，病毒構(gòu)建正確。病毒滴度按Reed＆Muench 法計算為2. 5 × 108TCID 50/ml，-80 ℃保存病毒備用。2.3 EGFP 及NICD 在人肝癌細胞株HepG2 中的表達 Ad-EGFP-NICD-Myc 轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2(MOI=150)3 d，熒光顯微鏡觀察，見EGFP 及NICD獲得穩(wěn)定表達(見圖5)。

圖2 RT-PCR 鑒定重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc 的NICD M:Marker;1:陰性對照;2:以pCDNA3-ICN#4質(zhì)粒為模板的PCR 產(chǎn)物(陽性對照);3 ～6:以pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc 菌液為模板的PCR 產(chǎn)物 圖3 酶切鑒定重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc M1 ～M2:Marker;1:NotⅠ+HindⅢ雙酶切質(zhì)粒后出現(xiàn)5 300 bp 和1 800 bp 左右兩條帶Fig 2 RT-PCR products of pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc M:DNA marker;1:negative control;2:positive control;3 ～6:PCR products of pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc with Notch1-NotⅠ-F and Notch1-Myc-HindⅢ-R primers Fig 3 Digestion products of pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc with enzyme M1 ～M2:DNA marker;1:the digestion products of pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc with NotI and Hind Ⅲ

圖4 重組腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc 的鑒定 M:Marker(DL2000);1:陰性對照;2:以Ad-EGFP-NICD-Myc 基因組DNA為模板擴增NICD 基因的PCR 產(chǎn)物(1 800 bp);3:以Ad-EGFPNICD-Myc 基因組DNA 為模板擴增EGFP 基因的PCR 產(chǎn)物(555 bp)Fig 4 PCR products of Ad-EGFP-NICD-Myc M:DNA marker;1:negative control;2:PCR products of Ad-EGFP-NICDMyc with -NotⅠ-F and Myc-Hind Ⅲ-R primers;3:PCR products of Ad-EGFP-NICD-Myc with EGFP-F and EGFP-R primers

圖5 病毒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2 后EGFP 及NICD 的表達A:DAPI 標記的肝癌細胞核，呈藍色(200 ×);B:與A 為同一視野，Ad-EGFP-NICD-Myc 病毒感染肝癌細胞后EGFP 表達，呈綠色(200 ×);C:與A 為同一視野，Ad-EGFP-NICD-Myc 病毒感染肝癌細胞后NICD-Myc 表達，呈紅色(200 ×);D:A、B 和C 的合成圖(200 ×)Fig 5 Expression of EGFP and NICD of HepG2 infected with Ad-EGFP-NICD-Myc A ～C:the same cells viewed under a fluorescence microscope;A:nuclei of HepG2 cells (DAPI-labeled blue staining，original magnification 200 × );B:EGFP (green staining，original magnification 200 ×);C:NICD (red staining，original magnification 200 ×);D:a merger of A，B and C

3 討論

Notch 信號是一個在進化中高度保守的通路，在胚胎發(fā)育和細胞命運的決定中發(fā)揮重要的作用。Notch 基因編碼Ⅰ型跨膜糖蛋白，是保守的細胞膜表面受體，可以通過與鄰近細胞表面表達的Notch 配體相互作用而被激活。Notch 信號由其配體誘導(dǎo)的蛋白水解反應(yīng)觸發(fā)，Notch 信號受體經(jīng)過γ-secretase 復(fù)合物的裂解產(chǎn)生Notch 蛋白的胞內(nèi)區(qū)(NICD)。NICD 進入細胞核內(nèi)，激活Su(H)/CBF1 家族轉(zhuǎn)錄因子，通過對靶基因表達的調(diào)控來調(diào)節(jié)細胞。

Notch 信號在肝癌中的表達，以及對肝癌細胞生長調(diào)控機制的認識及取得的成就遠遠大于對肝癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移機制的認識。陳勇等［4］培養(yǎng)小鼠肝癌細胞株H22，將細胞隨機分為A、B、C 組，分別加入Notch信號激活劑rhNF-κB、抑制劑DAPT 及PBS 共培養(yǎng)48 h。結(jié)果顯示:培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，A、B 組與C 組比較，細胞增殖差異明顯。與C 組比較，A 組細胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA 及其蛋白表達量均顯著增加，B 組細胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA 及其蛋白表達量均顯著降低。說明Notch1 信號通路在抑制小鼠肝癌細胞株H22 增殖、促進其凋亡中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，其機制可能與調(diào)節(jié)靶基因Hesl、Bcl-2 表達有關(guān)。周建中等［5］研究說明上調(diào)Notch1 的表達能促進Hes1 與Hes2 表達水平并抑制肝癌細胞HepG2 增殖。Suwanjunee 等［6］采用Notch 信號抑制劑GSI，非選擇性阻斷肝癌細胞株HepG2 的Notch 信號，結(jié)果有效抑制肝癌細胞的增殖，GSI 通過下調(diào)Hes1 的表達，抑制肝癌增殖;Ning 等［7］研究人員應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)，選擇性抑制肝癌細胞株HEP3B、SK-Hep-1、SNU449 細胞Notch1 受體的激活，下調(diào)ICN 的表達，結(jié)果抑制肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。然而對于Notch 信號在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移研究所見相對較少。Wang 等［8］通過Real-time PCR 的方法證實肝癌患者的肝癌組織中Notch1(82/82)和Jagged1(56/82)基因表達率高，并證實Notch1 基因的表達水平與肝癌的侵襲相關(guān)，與肝癌的腫瘤大小及腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量并不相關(guān)。劉虹等［9］采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測65 例肝癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中Notch1 和Jagged1 蛋白的表達。結(jié)果顯示:在肝癌和癌旁正常組織中，Notch1 的陽性表達率分別為16.9%和90.8%;Jagged1 的陽性表達率分別為10.9%和86.2%，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。Zhou 等［10］也通過應(yīng)用Notch 信號抑制劑(DAPT)證實下調(diào)Notch 信號抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch 信號通過ERK1/2 細胞信號的介導(dǎo)，影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成的關(guān)鍵基因和蛋白(MMP-2、MMP-9 和VEGF)，從而抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究使用AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)，利用細胞內(nèi)同源重組，在Cre-loxP 重組酶介導(dǎo)下，使轉(zhuǎn)染293 細胞的穿梭質(zhì)粒和輔助大質(zhì)粒發(fā)生定點重組，產(chǎn)生E1、E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。本實驗快速得到重組腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc。且在預(yù)實驗中也采用了空載體慢病毒及腺相關(guān)病毒進行感染人肝癌細胞株HepG2，但感染效率都沒有腺病毒感染效率高。猜測這可能是由于病毒的來源不同造成細胞感染效率的不同，或者其他的一些原因所致，此方面的問題還有待于進一步的研究。同時預(yù)實驗中我們也進行了脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2 實驗，發(fā)現(xiàn)由于LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體對于人肝癌細胞株HepG2 細胞毒性作用特別明顯，轉(zhuǎn)染效率較低。因此，通過本實驗認為腺病毒攜帶外源基因，可以高效地感染人肝癌細胞株HepG2，而AdMax 腺病毒包裝系統(tǒng)，也是穩(wěn)定的腺病毒載體系統(tǒng)。

本實驗中為了確定腺病毒攜帶外源基因在人肝癌細胞株HepG2 中的表達，我們在構(gòu)建腺病毒載體時設(shè)計了雙啟動子，即同時啟動表達EGFP 及目的基因的雙表達框，避免了EGFP 融合目的基因后對于目的基因在細胞內(nèi)作用的影響，而EGFP 的表達則易于我們在實驗中對于病毒感染細胞情況的分析。本實驗結(jié)果顯示，重組腺病毒感染人肝癌細胞株HepG2 后，人肝癌細胞株HepG2 穩(wěn)定表達EGFP 及NICD。

總之，本研究結(jié)果顯示腺病毒載體在介導(dǎo)外源基因Notch1 胞內(nèi)段轉(zhuǎn)導(dǎo)人肝癌細胞株HepG2 及其表達方面具有明顯的優(yōu)勢，這為我們下一步的研究，即轉(zhuǎn)染Notch 信號受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)，加強人肝癌細胞株HepG2 的Notch 信號表達，觀察Notch 信號對于人肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究提供了基礎(chǔ)。這將幫助我們更好地認識Notch 信號在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，隨著研究的深入，Notch 信號作為新一類抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的治療靶點將具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］ Oishi N，Wang XW. Novel therapeutic strategies for targeting liver cancer stem cells［J］. Int J Biol Sci，2011，7(5):517-535.

［2］ Sonoshita M，Aoki M，F(xiàn)uwa H，et al. Suppression of colon cancer metastasis by Aes through inhibition of Notch signaling［J］. Cancer Cell，2011，19(1):125-137.

［3］ Hu YJ，Han MZ，Hu YH. Relationship between Notch signaling pathway and primary liver cancer ［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2013，22(7):611-614.胡彥建，韓明子，胡彥華. Notch 信號通路與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究進展［J］. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22(7):611-614.

［4］ Chen Y，Jin XY，Liang Y，et al. The role and significance of Notch signaling pathway in the proliferation and apoptosis of H22 cells in mice［J］.Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery，2012，24(6):470-473.陳勇，金曉燕，梁勇，等. Notch 信號通路在小鼠肝癌細胞H22 增殖凋亡中的作用及意義［J］. 肝膽胰外科雜志，2012，24(6):470-473.

［5］ Zhou JZ，Zhou JH. Effect of Notch1 expression on biological behaviour of human hepatocarcinoma cell HepG2［J］. Jiangsu Med J，2012，38(18):2127-2130.周建中，周家華. Notch1 表達對肝癌細胞HepG2 生物學(xué)行為的影響［J］. 江蘇醫(yī)藥，2012，38(18):2127-2130.

［6］ Suwanjunee S，Wongchana W，Palaga T. Inhibition of gamma-secretase affects proliferation of leukemia and hepatoma cell lines through Notch signaling［J］. Anticancer Drugs，2008，19(5):477-486.

［7］ Ning L，Wentworth L，Chen H，et al. Down-regulation of Notch1 signaling inhibits tumor growth in human hepatocellular carcinoma［J］.Am J Transl Res，2009，1(4):358-366.

［8］ Wang XQ，Zhang W，Lui EL，et al. Notch1-Snail1-E-cadherin pathway in metastatic hepatocellular carcinoma［J］. Int J Cancer，2012，131(3):E163-E172.

［9］ Liu H，Li J. The expression and clinical significance of Notch1 receptor and Jagged1 ligand gene in hepatocellular carcinoma［J］. China Journal of Modern Medicine，2012，22(10):45-48.劉虹，李建. Notch1 受體和配體分子Jagged1 蛋白在肝癌組織中的表達及意義［J］. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(10):45-48.

［10］ Zhou L，Wang DS，Li QJ，et al. Downregulation of the Notch signaling pathway inhibits hepatocellular carcinoma cell invasion by inactivation of matrix metalloproteinase-2 and -9 and vascular endothelial growth factor［J］. Oncol Rep，2012，28(3):874-882.