胰高血糖素樣肽-1 對糖尿病大鼠胃排空的非受體通路的影響

李雪梅，魏良洲，田字彬，王利華，丁雪麗，苗瑛暉

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 青島266003

GLP-1 是由腸黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞L 細(xì)胞受到營養(yǎng)素刺激而分泌的腸源性激素，它能促進(jìn)胰島素分泌、降低血糖、延緩胃排空以及控制食欲等，對糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有一定的抑制作用。GLP-1 與胃排空關(guān)系密切，然而其作用機(jī)制目前尚不清楚，較多研究報道GLP-1通過與GLP-1R 結(jié)合發(fā)揮作用，但GLP-1 能否通過非受體途徑發(fā)揮以上作用的研究較少。本實驗通過構(gòu)建糖尿病模型，室旁核注射GLP-1R 激動劑GLP-1(7-36)或拮抗劑Exendin(9-39)，檢測下丘腦GLP-1R mRNA相對表達(dá)及胃排空變化情況，進(jìn)一步探討中樞神經(jīng)系統(tǒng)GLP-1 的非受體信號通路對糖尿病患者胃排空的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Wistar 大鼠40 只，體質(zhì)量250 ～260 g，購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心實驗動物室(許可證號SCXK 魯20130001)。STZ及GLP-1(7-36)均購自美國Sigma 公司，Exendin(9-39)購自美國Anaspec 公司，Trizol 溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒均購自大連寶生物公司，引物GLP-1R 購自南京金斯瑞生物科技有限公司，引物β-actin 購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備:大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC 組)、糖尿病組(DM 組)、GLP-1 干預(yù)組(GLP組)、Exendin 聯(lián)合GLP-1 干預(yù)組(E-G 組)及Exendin干預(yù)組(Exendin 組)。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，禁食16 h，禁水2 h，將STZ 溶于pH 值約為4.4 的檸檬酸緩沖液中，配置成10 mg/ml 濃度的STZ 溶液。除NC 組以外的其余4 組大鼠均按60 mg/kg 體質(zhì)量一次性腹腔注射STZ 溶液，NC 組注射相同體積的檸檬酸緩沖液，自由進(jìn)飲食，72 h 后用三棱針穿刺大鼠尾靜脈取血，測得隨機(jī)血糖≥16. 7 mmol/L 確定糖尿病模型制備成功。

1.2.2 下丘腦PVN 區(qū)置管:手術(shù)時，大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，取俯臥位置于腦部立體定位儀上，沿頭部正中縱行切開，剝離清除骨膜，清楚暴露前囟，參照Paxinos-Watson 大鼠腦立體定位圖譜，下丘腦PVN區(qū)定位于矢狀縫旁開0.3 mm，前囟后1.8 mm，深度0.8 mm，用電鉆在位點標(biāo)記處小心鉆開顱骨，將內(nèi)徑0.4 mm，外徑0.5 mm，長15 mm 的不銹鋼套管垂直置于一側(cè)PVN 區(qū)，并用自凝牙托粉固定套管于顱骨上。預(yù)實驗時重復(fù)此實驗，直至5 只大鼠經(jīng)固定及冷凍切片均能準(zhǔn)確定位該區(qū)域。術(shù)后大鼠單獨飼養(yǎng)，每天腹腔注射4 萬單位青霉素預(yù)防感染，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開始PVN 區(qū)注射藥物。

1.2.3 PVN 區(qū)藥物微量注射:在大鼠清醒狀態(tài)下，用微量注射器經(jīng)PVN 區(qū)套管緩慢給藥。GLP 組先緩慢注射60 ng/μl 的GLP-1(7-36)5 μl，再注射生理鹽水(NS)5 μl;Exendin 組先注射100 ng/μl 的Exendin(9-39)5 μl，再補充NS 5 μl;E-G 組先后緩慢注射Exendin(9-39)、GLP-1(7-36)各5 μl;NC 組及DM 組均給予10 μl NS。連續(xù)給藥3 d。

1.2.4 胃排空的測定:大鼠禁食16 h，禁水2 h 后，取50 mg/dl 甲基纖維素-酚紅溶液2 ml 灌胃，15 min 后處死大鼠，迅速開腹結(jié)扎鼠胃的賁門口及幽門口，將整個鼠胃取出并沿胃大彎切開，用蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物并定容至20 ml，然后加入濃度為0.5 mol/L 的NaOH溶液20 ml 攪拌混勻，靜置1 h 后取5 ml 上清液，加入200 g/L 的三氯乙酸0.5 ml 去蛋白，離心機(jī)以3 500 r/min 離心10 min，取上清液用分光光度計在560 nm 波長下檢測吸光度值。另外取甲基纖維素-酚紅溶液2 ml，先后加入蒸餾水18 ml，NaOH 溶液20 ml、三氯乙酸4 ml 混勻，測吸光度值，大鼠胃排空率=(1 -實測酚紅吸光度/標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度)×100%。

1.2.5 實時熒光定量PCR 法測定大鼠下丘腦GLP-1R mRNA 的表達(dá):處死大鼠后，迅速取下丘腦置于RNA 保存液中保存。取下丘腦組織50 ～100 mg，用Trizol 法提取總RNA，取500 ng 總RNA 用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR 反應(yīng)。GLP-1R 上游引物:5＇-TGTACCTGAGCATAGGCTGG-3＇，下 游 引 物:5＇-GCTCCCAGCTCTTCCGAAAC-3＇;B-actin 的 上 游 引 物:5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇，下 游 引 物:5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇，反應(yīng)體系10 μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃;PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)50 次，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，分析DNA 擴(kuò)增曲線，使用專用數(shù)據(jù)C 處理軟件獲取數(shù)據(jù)，以2-△△CT代表目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。本實驗中熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線均呈典型的S 型，融解曲線呈單峰，可以排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，得到的CT 值可信。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)均用x ±s 表示，組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。胃排空率與下丘腦GLP-1R mRNA 相對表達(dá)量之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 腹腔注射STZ 3 d 后，大鼠出現(xiàn)多飲、多尿及多食癥狀，并且癥狀逐漸加重。1 周時，糖尿病大鼠明顯消瘦，精神萎靡，活動遲緩，毛色干枯不光澤，但注射GLP-1(7-36)后的糖尿病大鼠飲食及尿量均減少，而精神及活動情況與其他組無明顯不同。

2.2 注射ST2 2 周后各組大鼠空腹血糖比較 DM組大鼠血糖較NC 組明顯升高(t =18.41，P ＜0.05);GLP 組血糖較NC 組升高(t =21.22，P ＜0.05)，但較DM 組、Exendin 組降低(t =10.57、15.84，P 均＜0.05);E-G 組血糖較GLP 組、NC 組均升高(t=16.57、31.70，P 均＜0.05)，但較DM 組、Exendin 組降低(t =3.40、4.72，P 均＜0.05);Exendin 組血糖較DM 組無明顯差異(t=0.134，P ＞0.05，見表1)。

表1 各組大鼠空腹血糖、胃排空率及下丘腦GLP-1R mRNA 表達(dá)的比較(x±s)Tab 1 Comparison of the fasting blood-glucose，gastric emptying and expression of GLP-1R in hypothalamus in each group (x±s)

2.3 注射ST2 酶后各組大鼠下丘腦GLP-1R mRNA表達(dá)的比較 DM 組下丘腦GLP-1R mRNA 表達(dá)與NC組比較無明顯差異(t =0.39，P ＞0.05);GLP 組及EG 組下丘腦GLP-1R mRNA 表達(dá)較DM 組、NC 組、Exendin 組均增高(t=4.44、4.04、4.46，P 均＜0.05);EG 組下丘腦GLP-1R mRNA 表達(dá)較GLP 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t =0.54，P ＞0.05)，較Exendin 組表達(dá)量增高(t =7.42，P ＜0. 05);Exendin 組下丘腦GLP-1R mRNA 表達(dá)較DM 組、NC 組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t =0.01、0.41，P 均＞0.05，見表1)。

2.4 注射ST2 2 周后各組大鼠胃排空率的比較 DM組胃排空率明顯高于NC 組(t =18.56，P ＜0.05);GLP 組胃排空率較DM 組、E-G 組、Exendin 組均降低(t=22.58、10.51、33.42，P 均＜0.05)，但仍明顯高于NC 組(t=5.30，P ＜0.05);E-G 組胃排空率高于NC組(t=11.37，P ＜0.05)，但比DM 組、Exendin 組降低(t=9.59、11.84，P 均＜0.05);Exendin 組胃排空率較NC 組明顯增高(t =20.56，P ＜0.05)，較DM 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.36，P ＞0.05，見表1、圖1)。

圖1 注射ST2 2 周后各組大鼠胃排空率的比較Fig 1 Comparison of the gastric emptying in each group

2.4 各組大鼠胃排空率和下丘腦GLP-1R 表達(dá)之間的相關(guān)性分析 NC 組、DM 組及E-G 組大鼠的胃排空率與下丘腦的GLP-1R 表達(dá)之間無明顯相關(guān)性(r =-0.118、0.238、0.31，P ＞0.05)，而GLP 組及Exendin組大鼠胃排空率與下丘腦的GLP-1R 表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r = -0.714、-0.881，P ＜0.05)。

3 討論

GLP-1 是消化道L 細(xì)胞通過對胰高血糖素樣原基因產(chǎn)物進(jìn)行組織特異性轉(zhuǎn)錄、加工后產(chǎn)生的肽類激素。在進(jìn)食后，該類腸源性激素可以促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用，另外，還能延緩胃排空，減少腸蠕動和胃液分泌，抑制食欲及攝食等［1］。其受體廣泛表達(dá)于胰腺α 和β 細(xì)胞、胃、小腸黏膜、心、肺以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)GLP-1R 主要表達(dá)于室旁核(PVN)，迷走神經(jīng)復(fù)合體(DVC)及伏核(NAc)等區(qū)域。

Exendin(9-39)是一種強有效的GLP-1R 拮抗劑，它能與GLP-1R 特異性結(jié)合［3］，從而阻斷GLP-1 與其受體結(jié)合，抑制GLP-1 發(fā)揮生物學(xué)作用。有人曾做過這樣一個實驗，給麻醉的老鼠分別灌注一定量葡萄糖、精氨酸、GLP-1、促胰島素因子(GIP)以及血管活性腸肽(VIP)，并在此基礎(chǔ)上給予一定量Exendin(9-39)，觀察Exendin(9-39)對這些促胰島素分泌物質(zhì)的影響。結(jié)果證實，Exendin(9-39)能顯著抑制GLP-1 誘導(dǎo)的餐后促胰島素分泌作用，但是對其他激素作用不大，提示Exendin(9-39)與GLP-1R 的結(jié)合具有特異性。因此，該實驗用Exendin(9-39)與GLP-1 競爭性結(jié)合GLP-1R，阻斷GLP-1 受體結(jié)合途徑是合理的。

GLP-1 與胃排空關(guān)系密切，目前其影響胃排空的機(jī)制尚不明確。有研究顯示，腹腔內(nèi)注射GLP-1R 激動劑，可以經(jīng)上行神經(jīng)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化中樞調(diào)控胃腸動力的神經(jīng)元，通過外周與中樞協(xié)同抑制胃排空［4］。下丘腦含有較多調(diào)節(jié)胃腸運動、攝食行為及食欲的核團(tuán)，如PVN、ARC 等，其中PVN 區(qū)存在較高密度的GLP-1R。Al-Sabah 等運用GLP-1 類似物與受體的胞外域及7 次跨膜域結(jié)合實驗提出“多肽-受體”相互作用模型［5］。目前研究多認(rèn)可該“多肽-受體”模式:GLP-1 作為第一信號，與GLP-1R 特異性結(jié)合，通過cAMP 作為第二信使激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。但是對于GLP-1 非受體作用途徑的研究很少，本實驗根據(jù)Exendin(9-39)對受體的阻斷效應(yīng)，探索其是否通過非受體途徑發(fā)揮作用。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，補充外源性GLP-1 能使糖尿病大鼠PVN 區(qū)GLP-1R 表達(dá)上調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)GLP-1除了與受體結(jié)合發(fā)揮作用，還可以通過其他途徑發(fā)揮作用。近些年發(fā)現(xiàn)一種新的攝食神經(jīng)肽nesfatin-1［6］，該類激素大量存在于中樞與調(diào)節(jié)攝食相關(guān)的核團(tuán)，如下丘腦的弓狀核、PVN、視上核及孤束核等［6-9］，日本Oh-I 等［6］發(fā)現(xiàn)向側(cè)腦室注射nesfatin-1 能強有力抑制大鼠攝食，長期注射還能使體質(zhì)量明顯下降。Stengel等［10］研究發(fā)現(xiàn)中樞注射nesfatin-1 能抑制胃排空，但其具體機(jī)制目前還不清楚。Nesfatin-1 在下丘腦室旁核有大量存在，且同GLP-1 作用類似，能延緩胃排空，減少攝食等，故我們推測在中樞GLP-1 可能與nesfatin-1 有協(xié)同作用，通過一定途徑激活迷走神經(jīng)，共同延緩胃排空。另外，有研究發(fā)現(xiàn)nesfatin-1 能促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗［11］，這也在一定程度上支持GLP-1 與nesfatin-1 有共同的作用通路。近幾年研究較為熱點的還有g(shù)hrelin/obestain，它們也是攝食調(diào)節(jié)肽，能夠通過中樞或外周參與胃腸生理活動調(diào)節(jié)［12-13］。Hagemann 等［14］研究發(fā)現(xiàn)GLP-1 抑制食欲減慢胃排空可能是由于ghrelin 分泌受到抑制實現(xiàn)的。Ariga 等［15］研究表明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠早期固體胃排空加快，并且內(nèi)源性ghrelin 明顯增加，提示ghrelin 與糖尿病早期胃排空變化有一定聯(lián)系。但GLP-1與這些激素的具體內(nèi)在聯(lián)系仍有待研究。

通過以上研究，我們推測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GLP-1除了與受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸動力等作用外，還存在其他通路影響糖尿病患者胃排空等，其中應(yīng)引起人們更多重視的是腦腸肽及胃腸激素，它們在糖尿病早期調(diào)節(jié)胃腸動力方面占有重要地位。GLP-1 對糖尿病有著強大的治療潛能，深入研究胃腸激素及腦腸肽之間的相互作用，明確GLP-1 作用機(jī)制，對治療進(jìn)展性糖尿病以及遏制早期胃腸動力紊亂的發(fā)生有著積極意義。

［1］ Baggio LL，Drucker DJ. Clinical endocrinology and metabolism. Glucagon-like peptide-1 and glucagon-like peptide-2［J］. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2004，18(4):531-554.

［2］ Gautier JF，Choukem SP，Girard J. Physiology of incretins (GIP and GLP-1)and abnormalities in type 2 diabetes［J］. Diabetes Metab，2008，34 Suppl 2:S65-S72.

［3］ Palladino AA，Sayed S，Levitt Katz LE，et al. Increased glucagon-like peptide-1 secretion and postprandial hypoglycemia in children after Nissen fundoplication ［J］. J Clin Endocrinol Metab，2009，94(1):39-44.

［4］ Baggio LL，Huang Q，Brown TJ，et al. A recombinant human glucagon-like peptide (GLP)-1-albumin protein (albugon)mimics peptidergic activation of GLP-1 receptor-dependent pathways coupled with satiety，gastrointestinal motility，and glucose homeostasis［J］. Diabetes，2004，53(9):2492-2500.

［5］ Al-Sabah S，Donnelly D. A model for receptor-peptide binding at the glucagon-like peptide-1 (GLP-1)receptor through the analysis of truncated ligands and receptors［J］. Br J Pharmacol，2003，140(2):339-346.

［6］ Oh-I S，Shimizu H，Satoh T，et al. Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus［J］. Nature，2006，443(7112):709-712.

［7］ Brailoiu GC，Dun SL，Brailoiu E，et al. Nesfatin-1:distribution and interaction with a G protein-coupled receptor in the rat brain［J］. Endocrinology，2007，148(10):5088-5094.

［8］ Kohno D，Nakata M，Maejima Y，et al. Nesfatin-1 neurons in paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus coexpress oxytocin and vasopressin and are activated by refeeding［J］. Endocrinology，2008，149(3):1295-1301.

［9］ Fort P，Salvert D，Hanriot L，et al. The satiety molecule nesfatin-1 is co-expressed with melanin concentrating hormone in tuberal hypothalamic neurons of the rat［J］. Neuroscience，2008，155(1):174-181.

［10］ Stengel A，Goebel M，Yakubov I，et al. Identification and characterization of nesfatin-1 immunoreactivity in endocrine cell types of the rat gastric oxyntic mucosa ［J］. Endocrinology，2009，150 (1 ):232-238.

［11］ Gonzalez R，Reingold BK，Gao X，et al. Nesfatin-1 exerts a direct，glucose-dependent insulinotropic action on mouse islet beta-and MIN6 cells［J］. J Endocrinol，2011，208(3):R9-R16.

［12］ Wren AM，Seal LJ，Cohen MA，et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans ［J］. J Clin Endocrinol Metab，2001，86(12):5992.

［13］ Wang JY，Wang LH，Wei LZ，et al. Association of gastric emptying with ghrelin，obestatin and receptor (GHSR，GPR-39)in hypothalamus of diabetic rats ［J］. Natl Med J China，2010，90 (16):1137-1140.王金燕，王利華，魏良洲，等. 下丘腦中Ghrelin、Obestatin 水平及其受體與糖尿病大鼠胃排空的關(guān)系［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(16):1137-1140.

［14］ Hagemann D，Holst JJ，Gethmann A，et al. Glucagon-like peptide 1(GLP-1)suppresses ghrelin levels in humans via increased insulin secretion［J］. Regul Pept，2007，143(1-3):64-68.

［15］ Ariga H，Imai K，Chen C，et al. Does ghrelin explain accelerated gastric emptying in the early stages of diabetes mellitus?［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，294(6):R1807-R1812.